长期慢性<em&gt;铜绿假单胞菌</em&gt;在呼吸道感染小鼠

摘要

我们所描述的琼脂珠的方法建立持久的长期慢性铜绿假单胞菌呼吸道感染的小鼠模型。

摘要

慢性呼吸道感染的小鼠模型是在囊性纤维化（CF）的研究的重要资产，虽然有许多关于模型本身的担忧。炎症和感染的早期阶段，已被广泛研究使用铜绿假单胞菌琼脂珠的小鼠模型，而只有少数报道都集中在体内长期慢性感染。长期慢性感染的主要挑战仍然是低细菌的负担由P.假单胞菌和鼠周激发后感染的比例较低，表明细菌细胞被宿主逐步清除。

本文提出了获得有效的长期慢性感染小鼠的方法。此方法是基于P的嵌入绿脓杆菌临床分离株中的琼脂珠在体外 ，然后在C57Bl/6NCrl小鼠气管内滴注。双侧肺部感染与相关SEVERAL可测量读奏包括体重减轻，死亡率，慢性感染和炎性反应。该P.铜绿假单胞菌 RP73临床菌株优于PAO1参考实验室菌株，因为它导致了一个相对较低的死亡率，更严重的病变，以及更高的慢性感染。 体育铜绿假单胞菌定植可能会持续在肺超过三个月。鼠肺组织病理类似于CF治疗晚期慢性肺疾病。

此小鼠模型中最密切模仿人类疾病的过程中，都对发病机理的研究和对新疗法的评价可以使用。

引言

囊性纤维化（CF）是在囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）基因突变引起的遗传性疾病。这个基因编码表达于大多数上皮细胞的膜中的氯离子通道。支气管扩张症，粘液堵塞和脑实质的破坏主要是绿脓杆菌引起的感染，逐步导致严重的肺部疾病和死亡率在大多数的CF患者^1。了解CF的发病机制和新疗法的进一步发展依赖于动物模型与CF的特征。一些小鼠，转基因的CFTR基因，已经产生，但在这些物种的复述CF状肺病和见于CF患者几个其他器官异常的能力的限制已被广泛记载^2。

感染的发展是在CF动物模型的主要挑战之一。文献CL早表明慢性感染持久一个月以上，可以实现仅将小鼠接种菌嵌在固定剂如琼脂，琼脂糖，或海藻藻^3-5。这些固定剂提供在微需氧/厌氧条件下，使细菌的生长在小菌落的形状，类似于在CF患者⁶的粘液的生长。慢性感染的这个模型导致细菌在引起气道炎症和损伤⁷肺内的持久性。但是，根据所使用的方法，所述细菌菌株并接种在肺剂量，慢性感染小鼠在不同时间点恢复在肺的百分比和细菌负荷可以相差很大。特别是，对于长期慢性感染的主要挑战仍然是低细菌的负担由P.铜绿假单胞菌和鼠周挑战后感染的比例较低，说明THA吨的细菌细胞被宿主逐步清除。通过选择P。铜绿假单胞菌 RP73从CF卡的集合临床分离菌株^8，我们成功获得低死亡率，更严重的病变，慢性感染的比例较高与稳定的细菌负荷长达一个月的C57Bl/6NCrl小鼠。

本文详细介绍了嵌入P的方法在铜绿假单胞菌琼脂珠;我们已经感染小鼠气管内滴入，测得的细菌负荷和细胞因子在肺，收集支气管肺泡灌洗液和进行组织学检查。总体而言，这一协议将有助于研究人员在处理上发病^8,9极其重要的问题和对体育测试新疗法铜绿假单胞菌慢性感染^10,11。

研究方案

1。慢性感染的细菌的准备（三和前两天鼠标挑战）

1. 选择合适的P。假单胞菌菌株进行测试。
2. 接种P的一菌环绿脓杆菌从-80℃股票文化的胰酶大豆琼脂（TSA）板和孵化在37℃过夜。
3. 挑取单个菌落，接种到5ml胰酪胨大豆肉汤（TSB）在15毫升的管理单元皑皑管，并在摇床以200rpm在37℃过夜。

2。慢性感染的细菌嵌入在琼脂珠（一天前感染）

1. 取一小等分试样的细菌过夜培养物，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释1:50，测量光密度（OD）在600nm处。
2. 通过添加2外径在含20毫升新鲜TSB一个新的单元皑皑管稀释过夜细菌培养。
3. 在37℃下约3 -4小时至对数期在摇动培养箱中以200rpm的转速，直到总共10-15外径就达到了。
4. 在此期间，准备TSA，使TSB与1.5％琼脂，高压灭菌器，并在水浴中平衡在50℃。在水浴中平衡150毫升preautoclaved重矿物油中的锥瓶中，在50℃。
5. 一旦P。假单胞菌达到对数生长期，离心收集细菌细胞在2700×g离心15分钟，在4℃，并弃去上清液。
6. 重悬细菌沉淀在1ml无菌PBS和涡流彻底完全重悬沉淀。
7. 混合1毫升细菌悬浮液用9ml液体的TSA预平衡在50℃下
8. 加入10毫升TSA-P。假单胞菌混合物重矿物油（预先加热到50℃），并立即搅拌6分钟，在室温下进行。搅拌必须产生一个可见的涡流在油中。
9. 冷却该混合物至4℃，在最低藻搅拌EED为35分钟（ 图1）。
10. 在休息的冰琼脂珠油混合物额外20分钟。
11. 在4℃转移琼脂珠入50ml Falcon管并离心以2700×g离心15分钟
12. 准确地除去矿物油和洗涤用无菌PBS 6倍，如在步骤2.11中描述。洗涤三次后，将珠粒能借重力沉淀，而不是使用离心分离机。最后一次洗涤后，悬浮在琼脂珠在20〜30毫升PBS中。
13. 走珠（大约0.5毫升）的分装无菌均质。
14. 取100微升的均质珠和稀释的900微升无菌PBS。连续稀释1:10下降到^10-6。
15. 板连续稀释在TSA平板，包括未稀释的样品下降到10 ^-6孵育板在37℃下
16. 用倒置光学显微镜在几个领域测量珠径。珠子直径必须是100-200微米之间（ 图1）。
17. 隔夜存放珠子在4°C。

图1。琼脂珠的制备和小鼠感染的概述。 体育假单胞菌细胞重新悬浮于1ml的PBS中，并加入到9ml液体TSA（50℃）。将该混合物加到150ml的重矿物油在50℃下在烧瓶中，并在高速搅拌6分钟，在室温下进行。当将烧瓶冷却至4℃，缓慢搅拌35分钟，在琼脂凝固创建珠，和存在于混合物中的细菌被嵌入到琼脂珠。细节包含细菌细胞的琼脂珠的是（A）所示。用无菌PBS以几次洗涤除去矿物油后，在琼脂珠悬浮准备f或接种于小鼠的肺部通过气管内注射（B） 点击此处查看大图 。

3。小鼠挑战与琼脂珠

伦理声明：此协议与实验遵循的圣Raffaele科学研究所动物保健和伦理委员会的指导方针。

1. 计数在TSA板的菌落形成单位数（CFU），以确定在琼脂珠悬浮液的CFU / ml的数量。稀释的琼脂珠用无菌PBS以2-4×10 ⁷ CFU / ml的达到1-2×10 ⁶的最优接种在50μl。
2. 麻醉C57Bl/6NCr（20-22克，6〜8周龄）的雄性小鼠用氯胺酮（50毫克/毫升）和甲苯噻嗪（5毫克/毫升）在0.9％NaCl中通过施用0.002毫升/克体重的体积腹腔注射。
   注：麻醉被认为是ADEQ审视你们当动物仍然停留静静地，不响应外界刺激，并有恒定的心脏和呼吸速率。
3. 鼠标放置在仰卧位。消毒鼠标的大衣用70％乙醇。
4. 通过皮肤的垂直切口暴露气管插管和气管，用无菌的，灵活的22政0.9毫米x 25毫米静脉导管，保持注意力，除去stylette而向下移动进入气管。插入导管不宜过深入气管。到达隆突（分叉）之前停止。
5. 立即取50微升的琼脂珠悬浮液体积1 ml注射器，并将它附加到导管。轻轻推动注射器的活塞，使小珠被植入到肺。用夹子缝合关闭切口。
6. 将动物加热垫，直到完全清醒。

4。小鼠评价

1. 每天观察小鼠的临床症状，包括上衣质量，姿势，下床活动，和水合状态。每日监测体重。那失去≥20％小鼠体重必须安乐死。
2. 遵循第5点收集支气管肺泡灌洗液（BAL）和点6或7为肺的收集和总CFU分析，组织学分析，在BAL中，细胞因子分析和总细胞计数方面的炎症反应，而髓过氧化物酶（MPO）活性。

5。支气管肺泡灌洗液的收集和分析

1. 通过CO ₂吸入安乐死的小鼠。
2. 将鼠标放置在仰卧位。消毒鼠标的大衣用70％乙醇。
3. 暴露气管和胸廓的皮肤垂直切口。通过切割膜片暴露肺部。
4. 插入缝合线使用镊子气管和下插管气管用无菌的，灵活的22克0.9毫米x 25毫米IV导管。拉动缝合线的两个端部结合的钙theter到气管和打结围绕气管的线程。
5. 取1毫升的RPMI 1640中使用1毫升注射器的体积并将其连接到导管。推动注射器的活塞来洗肺和立即回收液体，将其存储在一个15毫升的试管中。
   注：如果细胞因子是待分析，加蛋白酶抑制剂，以RPMI 1640。
6. 共3毫升的RPMI重复此步骤三次。从现在起，储存在冰BAL液。去对肺的收集和分析步骤6。
   注：请注意，并非所有的液体将被检索（毫​​升最大2.8）。
7. 对于存在于支气管肺泡灌洗液细菌定量，品尝一小等份（300微升），连续稀释1:10无菌PBS，板在TSA平板孵育37℃过夜。
8. 用倒置光学显微镜稀释的BAL液1:2的比例加在Burker细胞计数室图尔克溶液的等分计数细胞总数。
9. 离心机的Remaining BAL液在330×g离心8分钟，在4℃下取上清用于ELISA细胞因子分析，在-80°C存放按照步骤,5.10-5 .13为差异细胞计数由细胞离心涂片。
10. 如果颗粒是红色的，裂解重悬沉淀在250-300微升RBC裂解缓冲液中的红细胞在超纯蒸馏水1:10稀释3分钟。用2ml的PBS，离心中和在330×g离心8分钟，在4℃下
11. 弃上清，重悬沉淀在RPMI 10％胎牛血清（FBS）。使用量，将提供1×10 ⁶细胞/ ml时，基于总的细胞计数。
12. 放置显微镜载玻片和过滤器插入相应的插槽中朝向细胞离心涂片器的中心的纸板滤波器的细胞离心涂片。吸取150微升每个样品为以300×g离心5分钟的细胞离心涂片和离心机在cytocentrifuge适当的水井。
13. 染色载玻片通过使用商业试剂盒Romanowsky染色，根据毫安生产商产生的指示和如先前描述的^12。按照步骤,5.14-5 .17为MPO活性分析。
14. 离心BAL的剩余量，在380×g离心5分钟，在4℃下弃上清，重悬沉淀中加入250μl的十六烷基氯化铵0.5％的超纯蒸馏水以溶解细胞。该悬浮液可在-20℃下进行测定之前被冻结几天。
15. 离心机以16,000×g离心30分钟，在4℃，并用上清液在96孔板中进行MPO分析，加入一式两份的样品，以各需要良好，如果，也适当的样品稀释液。
16. 加至孔中的每个样品用等体积的3,3'，5,5' - 四甲基联苯胺（TMB）的底物的过氧化物酶。使反应发生在黑暗中为至少5分钟，直到有一个在颜色没有进一步发展。
17. 停止反应，加入2 MH ₂ SO ₄的一次测量的OD在450nm处。 OD值将直接正比于过氧化物酶的活性。

6。在肺和细胞因子分析细菌负荷的测量

1. 后支气管肺泡灌洗液的收集，从小鼠肺切除，冲洗一下在无菌PBS，单独的叶，把它们放在一个圆底筒用2毫升无菌PBS并储存在冰。
   注：如果细胞因子是待分析，以PBS中添加蛋白酶抑制剂的试管中。
2. 无菌均质肺，从匀浆取一小等分试样（300微升），连续稀释1:10 PBS中，板在TSA平板孵育在37℃下过夜。请注意，总呼吸道细菌负荷将在BAL液和肺中发现的的CFUs的总和。
3. 离心剩余的匀浆以16,000×g离心30分钟，在4℃下取上清用于ELISA细胞因子分析，并储存在-80°C

7。组织学检查

<醇>

进行组织学分析，只对其中支气管肺泡灌洗液尚未收集到肺部，以保持肺部的方面和属性。

通过CO ₂吸入安乐死鼠标。

通过皮肤的垂直切口暴露胸廓，通过切割膜片暴露肺部。

消费肺，冲洗一下在PBS，分开叶，把它们放在含有5-10毫升10％中性缓冲福尔马林（4％甲醛），并储存在4℃下避光管。

在石蜡中嵌入肺，用标准程序。

用切片机切成5微米厚的切片。

染色玻片用苏木精和曙红染色，并盖上盖玻片的载玻片，根据标准程序。

用倒置显微镜明场检查幻灯片和显微镜连接到数码相机采集图像。

结果

当协议被正确完成后，P。铜绿假单胞菌琼脂珠将测量100-200微米之间，与倒置光学显微镜吹打少量琼脂珠悬浮在幻灯片中可以观察到。单个细菌细胞是可见的琼脂珠，如在图1中详细示出。

P的选择在琼脂珠制备用于铜绿假单胞菌菌株是至关重要的， 图2和表1示出以下的小鼠与P的感染中的数据获得铜绿假单胞?...

讨论

在P的关键步骤铜绿假单胞菌珠准备和鼠标的挑战，现报道如下。

用于小鼠的挑战的铜绿假单胞菌菌株是至关重要的。死亡率，慢性感染或间隙可能有所不同显著取决于用于挑战的细菌菌株。该P.铜绿假单胞菌 RP73临床菌株优于PAO1参考实验室菌株，因为它导致了一个相对较低的死亡率，更严重的病变，以及更高的慢性感染。在临床前研究的药物测试?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson	211823
Difco Agar, granulated	Becton Dickinson	214510
Heavy mineral oil	Sigma-Aldrich	330760-1L
S-(+)-Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	K1884
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich	X1251
1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm	PIC	3071250300350
Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm	Becton Dickinson	381223
Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved	Fine Science Tools	11152-10
Scissors, Iris, 11 cm, straight	World Precision Instruments	501758
Suture clips	Fine Science Tools	12040-01
Suture thread	Fine Science Tools	18020-40
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
Complete protease inhibitor cocktail	Roche	11836145001
Fast-Read 102 Burker disposable chamber	Biosigma	390497
Tuerk solution	Fluka	93770
RBC lysis buffer	Biolegend	420301
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F
EZ cytofunnel	Thermo Scientific	A78710021
Superfrost ultra plus microscope slides	Thermo Scientific	J3800AMNZ
Diff-Quik Romanowsky staining set	Medion Diagnostics	130832
Hexadecyltrimethylammonium chloride	Sigma-Aldrich	52366-10G
96-well EIA/RIA plate	Costar	3590
3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine	Sigma-Aldrich	T8665-1L
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501-1L
10% Neutral buffered formalin	Bio-Optica	05-01005Q
Harris hematoxylin non Papanicolau	Bio-Optica	05-M06004
Eosin plus alcoholic solution	Bio-Optica	05-M11007
Equipment
Shaking incubator	Amerex Instruments	Steady Shake 757
Water bath	Grant	SUB14
Homogenizer	Ystral
Precision balance	KERN	440-47N
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Low Cost Heating Pad	2biol	LCHP
Homogenization probe	Ystral	2366925(small)
Inverted optical microscope	Zeiss	Axioplan2
Camera (microscope)	Zeiss	Axiocam MRc5
Rotary microtome	Leica	RM2255