方法来描述自发和惊吓引起的步态中的鱼藤酮诱导的帕金森病模型<em&gt;果蝇</em

摘要

帕金森病是一种神经退行性疾病而导致的多巴胺能神经元在中枢神经系统的变性，造成运动缺陷。鱼藤酮车型帕金森氏症的果蝇 。本文概述了两种检测的特点所造成的鱼藤酮是自发性的，惊吓引起的运动缺陷。

摘要

帕金森病是一种神经退行性疾病而导致的多巴胺能神经元的变性，在中枢神经系统中，主要在黑质。这种疾病会导致电机的不足，这表现为强直，震颤和老年痴呆症的人。鱼藤酮是一种杀虫剂，通过抑制线粒体的电子传递链的功能引起的氧化损伤。它也被用来建模帕金森氏病的果蝇 。苍蝇有一个固有的负面geotactic反应，这迫使他们在被吓了一跳向上攀升。它已经确定，鱼藤酮引起早期死亡率和运动缺陷扰乱果蝇的爬它们已被窃听向下之后能力。然而，鱼藤酮对自发运动的效果没有记载。本研究概述了两个敏感，重复性好，高通量检测的表征鱼藤酮诱导的缺陷短期惊跳诱导运动和长期自发运动的果蝇 。这些测定法可便利地适用于表征运动缺陷和治疗剂的效力的其他果蝇模型。

引言

运动缺陷是帕金森氏病的主要症状，并在很大程度上引起黑质¹的多巴胺能神经元的退化。鱼藤酮是已被广泛研究的模型帕金森运动障碍果蝇 ^2-6酮类杀虫剂。鱼藤酮通过阻断氧化磷酸化途径，最终导致细胞死亡⁷导致的氧化损伤。多巴胺能神经元更容易产生鱼藤酮毒性，使得主要马达基于^2,7的化学品的影响。通过在果蝇诱发帕金森氏病的症状，我们就可以更好地了解疾病和纠正其症状^6,8-11。 果蝇提供了一个很好的模型来研究这种影响，因为它们的基因听话，易于维护，并且具有快速的生命周期。

几项研究已经表明，鱼藤酮引起短期惊跳诱导在果蝇 -当果蝇运动缺陷被保持在鱼藤酮补充食品，他们表现出惊人死不休^2-6后以较慢的负geotactic回应。他们未能在小瓶设备，迅速向上攀升对照试验表明了惊吓引起的运动缺陷。

鱼藤酮对长期的效果，自发运动不能很好地说明。 果蝇活动监视器（DAMS）已被成功地用于监测果蝇的昼夜节律运动研究^12,13。苍蝇被放置在单独的管，其被加载到DAM。该装置配备有红外线传感器，该计数的次数蝇打破了红外线光束的数目。这些计数可以用作原状的运动和活动^12,13的量度。通过将苍蝇在一个坝，鱼藤酮对他们的长期运动的效果可以表征。这项研究描述的方法来MEAS茜短期惊跳诱导运动和长期的自发运动，以便更好地理解的鱼藤酮介导的运动缺陷的影响。对运动缺乏模仿帕金森氏症表征是很重要的，因为它们允许它可以扭转这些运动缺陷等化合物的研究。

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研究方案

1， 果蝇惊吓引起的步态分析

1. 药物治疗
   1. 稳重的固定化所需的数字1-3（约8-12）日龄雄蝇使用_二氧化碳 ，并将其输送到含有药物的补充食品瓶。注：另麻醉剂如乙醚或冰可用于镇静苍蝇，使数量和处理。
   2. 允许蝇从镇静在水平位置上恢复20分钟（或直到恢复）与小瓶（防止蝇卡住上的食物），然后竖直放置的管形瓶中在12小时黑暗，12小时光照培养箱中在25℃下对于实验的其余部分。
2. 实验设置
   1. 通过标记周围的圆瓶用永久性记号笔分这双瓶设置成6.33厘米三个相等的部分。
   2. 后药物暴露3天后，转移蝇无麻醉入底小瓶中，并很快将样品瓶在开口上。用胶带将两小瓶加上透明胶带。
   3. 让苍蝇来适应新的环境15分钟。
   4. 在白色背景上把试管放入，并成立了数码相机从双瓶装置，在视图中的计时器适当的距离。确保整个装置是在一个单一的图像帧可见的，并且所有的苍蝇都在焦点。保持试验之间是一致的帧，马克相机和小瓶的位置。
3. 流动性分析
   1. 清晰地显示试验次数，药物治疗，并在摄像头视图计时器。
   2. 牢固地挖掘双小瓶装置对对接的3倍，并确保所有的苍蝇落入到小瓶的底部。同时启动定时器。
   3. 每隔5秒，1分钟，取该装置的图片。注：另外，视频可以被捕获并停在适当的时间间隔进行测量。
   4. 允许蝇恢复原状，持续1分钟。
   5. 重复2次以上每次试验之间1分钟的恢复时间。注意：每个设备需要5分钟才能完成数据采集。保持试验间攻类似的力量。多个（至少3个）装置能够同时处理容易。
4. 数据分析
   1. 查看照片和在每个部分随时间记录蝇的数目。计算苍蝇在每个部分随时间的百分比。注释：重复此用相同的苍蝇整个过程在感兴趣2或3个时间点，例如，3天，5和7。如果太多苍蝇死整个实验过程中，可以按比例增加原试验编号，以补偿对于死亡率。使用适当的统计分析的数据进行比较。

2， 果蝇自发活动分析

1. 食品制作
   1. 重组3克瞬间果蝇培养基用15ml去离子水和所需的鱼藤酮（或感兴趣的另一种药物）的剂量。
   2. 一旦食物混合，成为坚定的（约5分钟），谨慎地装载食物是约为1厘米，高为制造商提供透明管（3毫米x 65毫米）。通过小心地放置在管垂直于食品和扭转，直到它们可以与管内的食品被移除添加灌注食品的管中的药物。注意：它有利于把一个手指放在该管的开口，以形成真空。食品中不应含有任何气泡或有凹凸不平的表面的苍蝇能成为卡住。
2. 实验装置
   1. 放置在管的末端最接近食品的塑料盖。推在管尽可能少的塑料帽，因为它可以在小瓶内建立一个气泡，如果推到有力。
   2. 稳重1天岁的雄蝇以CO _2，并小心将1男飞入各管画笔。重复这取决于所需的试验次数。
   3. 堵塞该管最远离食品用小棉球，这可以从较大的​​商店手卷的端购买棉球。
   4. 允许苍蝇与管子来恢复在水平位置15分钟，确保所有的苍蝇都活着和活性。插入管放入DAM，并确保所有的管子都在同一位置相对于水坝。注意：可以将它们与监测的区域在所述小瓶的中间，或对所有的小瓶推到一边，以使管的端部正在被监视。注：在这个变化的方法请参见讨论。
3. 数据收集
   1. 将大坝在12小时黑暗，12小时光照培养箱设定为25℃。大坝连接到数据采集系统。打开坝软件，并根据喜好选择彬长至10分钟。开始收集数据，并允许该程序收集的数据为7天。注意：滨长度可以根据需要进行调整。
   2. 数据分析
      注：过程的数据，以获得每分钟的计数作为长期自发运动的量度。
      1. 打开大坝文件扫描程序和访问监控数据通过点击选择输入数据。
      2. 选择合适的显示器系列，并选择10分钟的间隔彬长。
      3. 在输出文件类型选择通道的文件。让所有其他选项为默认值。
      4. 点击扫描数据保存到指定的文件夹中。
      5. 在昼夜数据分析软件导入数据以得到每分钟的计数。注意：对于数据分析Clocklab软件常用。其他的选择也可以。

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结果

果蝇惊吓引起的步态分析

野生型， 州-S，苍蝇30秒（ 图1）后表现出的双管形瓶装置的仅约88％和苍蝇的顶部和底部部分的5％的鲁棒负geotactic响应分别。暴露于125μM和250μM的鱼藤酮3天蝇表明在果蝇中的顶端部分，并在果蝇中的底部的数目略有增加的数量略有减少。暴露于500μM的鱼藤酮蝇显示显著缺陷在负geotactic反应（P <0.05 ANOVA，邦弗...

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讨论

在这项研究中，我们描述了两个过程中帕金森病的鱼藤酮诱导的果蝇模型中同时测量长期自发运动和短期惊吓诱发运动。还可以测量在果蝇暴露于已知的建模帕金森氏病如其他药剂，百草枯^14，帕金森氏病，例如遗传模型，阿尔法-突触核蛋白突变体¹⁵中，并影响运动疾病其他蝇模型这些运动特征。对于这两种方法，替代的方法和修改可以被考虑。?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5 X 65 mm
Recipe for Rotenone + food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.