Méthodes pour caractériser spontanée et induite par Locomotion sursaut dans un modèle de la maladie de Parkinson induite de la roténone-de<em&gt; Drosophila</em

Résumé

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui résulte de la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans le système nerveux central, ce qui provoque des défauts de locomotion. modèles de roténone la maladie de Parkinson chez la drosophile. Le présent document décrit deux essais qui caractérisent les lacunes à la fois spontanées et surprendre induites locomotion causés par la roténone.

Résumé

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui résulte de la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans le système nerveux central, principalement dans la substance noire. La maladie provoque des déficiences motrices, qui présentent comme la rigidité, des tremblements et de la démence chez les humains. La roténone est un insecticide qui provoque des dommages oxydatifs en inhibant la fonction de la chaîne de transport des électrons dans les mitochondries. Il est également utilisé pour modéliser la maladie de Parkinson dans la drosophile. Les mouches ont une réponse négative geotactic inhérente, ce qui les obligent à monter vers le haut après avoir été surpris. Il a été établi que la roténone provoque des anomalies de mortalité et de locomotion début qui perturbent la capacité des mouches à grimper après qu'ils ont été exploitées vers le bas. Cependant, l'effet de la roténone sur le mouvement spontané n'est pas bien documenté. Cette étude décrit deux essais de débit sensibles, reproductibles, et élevés pour caractériser les carences induites roténone enlocomotion et la locomotion spontanée à long terme à court terme sursaut induite chez la drosophile. Ces dosages peuvent être facilement adaptés pour caractériser d'autres modèles de Drosophila de défauts de locomotion et de l'efficacité d'agents thérapeutiques.

Introduction

les irrégularités de locomotion sont un symptôme majeur de la maladie de Parkinson et sont en grande partie due à une dégradation des neurones dopaminergiques de la substantia nigra ^1. La roténone est un insecticide cétoniques qui a été largement étudié pour modéliser les déficits moteurs parkinsoniens chez la drosophile ^2-6. La roténone provoque des dommages oxydatifs en bloquant la voie de la phosphorylation oxydative, ce qui entraîne finalement la mort de la cellule ^7. Les neurones dopaminergiques sont plus sensibles à la toxicité de la roténone, ce qui rend les effets de la substance chimique principalement basée ^2,7 moteur. En induisant les symptômes de la maladie de Parkinson chez les mouches, nous pouvons mieux comprendre la maladie et ses symptômes remédier ^6,8-11. Drosophila fournit un bon modèle pour étudier cet effet parce qu'ils sont génétiquement docile, facile à entretenir, et ont un cycle de vie rapide.

Plusieurs études ont montré que la roténone provoque à court terme sursaut induitedéfauts de locomotion chez la drosophile de les mouches sont maintenus sur l'alimentation de la roténone complété, ils montrent une réponse plus lente geotactic négatif après sursaut ^2-6. Leur incapacité à monter vers le haut dans un appareil flacon aussi rapidement que les essais de contrôle indique des défauts de locomotion induite sursaut.

L'effet de la roténone sur le long terme, le mouvement spontané n'est pas bien décrite. Surveillance de l'activité chez la drosophile (barrages) ont été utilisés avec succès pour surveiller les mouvements chez la drosophile rythme circadien étudie ^12,13. Les mouches sont placés dans des tubes individuels, qui sont chargés dans la DAM. Cet appareil est équipé d'un capteur infrarouge, qui compte le nombre de fois où une mouche rompt le faisceau infrarouge. Ces chiffres peuvent être utilisés comme mesure de la locomotion et ^12,13 activité intacte. En plaçant les mouches dans un DAM, l'effet de la roténone sur leur locomotion à long terme peut être caractérisé. Cette étude décrit les méthodes à AEMlocomotion et la locomotion spontanée à long terme ure à court terme sursaut induite afin de mieux comprendre les effets de la roténone médiation déficiences motrices. Caractérisation des carences de locomotion mimant la maladie de Parkinson sont importants car ils permettent l'étude d'autres composés qui peuvent inverser ces défauts de locomotion.

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Protocole

1. Drosophila sursaut induite par dosage de locomotion

1. Traitement de la toxicomanie
   1. Calme pour immobiliser nombre désiré (environ 8-12) de 1-3 jour-vieux mâle vole en utilisant le CO ₂ et les transporter dans des flacons contenant de la nourriture de la drogue complété. Note: Un autre anesthésique par exemple, l'éther ou de la glace peut être utilisé pour endormir les mouches pour permettre le comptage et la manipulation.
   2. Autoriser les mouches de se remettre de la sédation pendant 20 minutes (ou jusqu'à ce que la récupération) avec le flacon en position horizontale (pour empêcher les mouches de se retrouver sur la nourriture) et puis placez le flacon en position verticale dans un endroit sombre de 12 h, la lumière incubateur de 12 h à 25 ° C pour le reste de l'expérience.
2. Dispositif expérimental
   1. Diviser cette configuration à double flacon en trois parties égales de 6,33 cm par marquage des cercles autour des flacons avec un marqueur permanent.
   2. Après 3 jours d'exposition au médicament, transfert vole sans anesthésie dans le flacon fond et placer rapidement le flacon hautsur l'ouverture. Collez les deux flacons avec du ruban adhésif transparent.
   3. Autoriser les mouches à s'acclimater à leur nouvel environnement pendant 15 min.
   4. Placer les flacons sur un fond blanc et mis en place un appareil photo numérique à une distance appropriée de l'appareil à double flacon avec une minuterie en vue. S'assurer que la totalité de l'appareil est visible dans un cadre photo unique et que toutes les mouches sont au point. Pour maintenir des cadres cohérents entre les essais, marquer l'emplacement de la caméra et le flacon.
3. Mobilité Assay
   1. Afficher clairement le numéro de l'essai, traitement de la toxicomanie, et la minuterie en vue de la caméra.
   2. Taper fermement l'appareil à double flacon contre le comptoir 3 fois et veiller à ce que toutes les mouches tombent au fond du flacon. Commencer simultanément la minuterie.
   3. Toutes les 5 secondes pendant 1 min, prendre une photo de l'appareil. Remarque: vous pouvez, une vidéo peut être capturé et mis en pause à des intervalles appropriés pour les mesures.
   4. Permettre de récupérer vol au repos pendant 1 min.
   5. Répétez 2 fois plus avec 1 min de temps de récupération entre chaque essai. Note: Chaque appareil doit prendre 5 minutes pour compléter la collecte de données. Maintenir la même force de taper entre les essais. Multiple (au moins 3) appareil peut être facilement manipulé simultanément.
4. Analyse des données
   1. Passez en revue les images et enregistrer le nombre de mouches dans chaque section au fil du temps. Calculer le pourcentage de mouches dans chaque section au fil du temps. Notes: Répétez cette procédure entière avec les mêmes mouches à 2 ou 3 points de temps d'intérêt, par exemple, jour 3, 5, et 7 Si trop de mouches meurent pendant l'expérience, il est possible d'intensifier le nombre de procès en première instance pour compenser pour la mortalité. Utiliser l'analyse statistique appropriée pour comparer les données.

2. Drosophila spontanée Locomotion Assay

1. Préparation des aliments
   1. Reconstituer 3 g de milieu Drosophila instantanée avec 15 ml d'eau désionisée et la roténone souhaitée(Ou un autre médicament d'intérêt) dosage.
   2. Une fois le mélange alimentaire est devenue ferme (environ 5 min), charger attentivement la nourriture à environ 1 cm de hauteur en fabricant fournis tubes transparents (5 mm X 65 mm). Ajouter le médicament perfusé nourriture pour les tubes en plaçant soigneusement les tubes verticalement dans la nourriture et les tordre jusqu'à ce qu'ils puissent être enlevés avec de la nourriture à l'intérieur du tube. Remarque: Il est utile de placer un doigt sur l'ouverture du tube pour créer un vide. Aliments ne doivent pas contenir de bulles d'air ou avoir une surface inégale que les mouches peuvent se coincer.
2. Configuration expérimentale
   1. Placer un capuchon en plastique sur l'extrémité du tube la plus proche de la nourriture. Poussez le couvercle en plastique sur le tube aussi peu que possible, car il peut créer une bulle d'air dans le flacon si on le pousse à force.
   2. Sedate 1 jour-vieux mâle vole en utilisant le CO ₂ et insérer délicatement 1 mâle mouche dans chaque tube avec un pinceau. Répéter en fonction du nombre d'essais souhaités.
   3. Branchez l'partie la plus éloignée du tube de la nourriture avec une petite boule de coton, qui peut être roulé à la main de grand magasin a acheté des boules de coton.
   4. Autoriser les mouches de récupérer les tubes en position horizontale pendant 15 minutes et faire en sorte que toutes les mouches sont vivants et actifs. Insérer les tubes dans DAM et assurez-vous que tous les tubes sont dans la même position par rapport au barrage. Remarque: il est possible de les placer à la zone de surveillance au moyen de l'ampoule, ou pour pousser tous les flacons sur le côté, de sorte que l'extrémité du tube est surveillée. Remarque: Voir la discussion des variations sur cette méthode.
3. Collecte des données
   1. Placez le DAM dans un endroit sombre 12 h, incubateur de lumière de 12 h réglé à 25 ° C. Connectez le DAM pour le système de collecte de données. Ouvrez le logiciel de DAM et dans les préférences, sélectionnez la longueur du bac à 10 min. Lancer la collecte des données et permettre au programme de collecte de données pendant 7 jours. Remarque: longueur Bin peut être ajustée si nécessaire.
   2. Analyse des données
      Remarque: Processobtenir les données de coups par minute en tant que mesure de la locomotion spontanée à long terme.
      1. Ouvrir le fichier DAM programme et l'accès de surveiller les données de numérisation, cliquez données de sélection d'entrée.
      2. Sélectionnez la plage de surveillance approprié et sélectionnez la longueur du bac à intervalles de 10 minutes.
      3. Dans le type de fichier de sortie choisir les fichiers de canal. Laissez toutes les autres options par défaut.
      4. Cliquez données de numérisation et enregistrer dans un dossier désigné.
      5. Importer des données dans un logiciel d'analyse de données circadien d'obtenir coups par min. Remarque: Pour l'analyse des données des logiciels Clocklab est couramment utilisé. D'autres options sont également disponibles.

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Résultats

Drosophila sursaut induite par dosage de locomotion

De type sauvage, Canton-S, les mouches ont montré une réponse négative geotactic robuste avec seulement environ 88% et 5% de mouches dans les parties supérieure et inférieure, respectivement, de l'appareil à double flacon après 30 secondes (Figure 1). Mouches exposées à 125 pM et 250 pM roténone pendant 3 jours ont montré une légère diminution du nombre de mouches dans la ...

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Discussion

Dans cette étude, nous décrivons deux procédures pour mesurer à la fois la locomotion spontanée à long terme et de la locomotion induite sursaut court-terme dans un modèle drosophile induit roténone de la maladie de Parkinson. On peut aussi mesurer ces caractéristiques de la locomotion chez les mouches exposés à d'autres agents pharmacologiques connus pour modéliser la maladie de par exemple de la maladie de Parkinson, le paraquat ^14, les modèles génétiqu...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5 X 65 mm
Recipe for Rotenone + food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.