Métodos para caracterizar espontánea y de sobresalto-inducida Locomotion en un modelo de enfermedad de Parkinson inducida por rotenona-de<em&gt; Drosophila</em

Resumen

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que resulta de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en el sistema nervioso central, causando defectos de locomoción. Rotenona modelos de la enfermedad de Parkinson en Drosophila. Este documento describe dos ensayos que caracterizan a las deficiencias de locomoción tanto espontáneos como inducidos por el sobresalto causado por la rotenona.

Resumen

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que resulta de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en el sistema nervioso central, principalmente en la sustancia negra. La enfermedad provoca deficiencias motoras, que presentan como rigidez, temblores y la demencia en los seres humanos. Rotenona es un insecticida que causa el daño oxidativo mediante la inhibición de la función de la cadena de transporte de electrones en la mitocondria. También se utiliza para modelar la enfermedad de Parkinson en la Drosophila. Las moscas tienen una respuesta geotáctico negativo inherente, que los obliga a subir hacia arriba al ser sorprendido. Se ha establecido que la rotenona causa defectos de mortalidad y de locomoción principios que alteran la capacidad de las moscas para subir después de haber sido golpeado ligeramente hacia abajo. Sin embargo, el efecto de la rotenona en movimiento espontáneo no está bien documentada. Este estudio describe dos ensayos de rendimiento sensibles, reproducibles y de alta para caracterizar deficiencias inducida rotenona-inlocomoción y la locomoción espontánea a largo plazo a corto plazo de sobresalto-inducida en Drosophila. Estos ensayos pueden ser convenientemente adaptados para caracterizar otros modelos de Drosophila de defectos de la locomoción y la eficacia de los agentes terapéuticos.

Introducción

Deficiencias de locomoción son el principal síntoma de la enfermedad de Parkinson y son causadas en gran parte por el deterioro de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra ^1. Rotenona es un insecticida cetónico que se ha estudiado ampliamente para modelar los déficits motores de Parkinson en Drosophila ^2-6. Rotenona causa daño oxidativo mediante el bloqueo de la vía de la fosforilación oxidativa, lo que provoca en última instancia, la muerte celular ^7. Las neuronas dopaminérgicas son más propensos a la toxicidad rotenona, por lo que los efectos de la sustancia química principalmente motor basa ^2,7. Mediante la inducción de síntomas de la enfermedad de Parkinson en las moscas, podemos comprender mejor la enfermedad y remediar sus síntomas ^6,8-11. Drosophila proporciona un buen modelo para el estudio de este efecto, ya que son genéticamente manejable, fácil de mantener, y tienen un ciclo de vida rápido.

Varios estudios han demostrado que la rotenona causa inducida por sobresalto corto plazodefectos de locomoción en la mosca Drosophila -cuando se mantienen en los alimentos suplementados con rotenona, que muestran una respuesta más lenta geotáctico negativo después de sobresalto ^2-6. Su incapacidad para subir hacia arriba en un aparato vial lo más rápidamente pruebas de control es indicativo de defectos de locomoción inducida de sobresalto-.

El efecto de la rotenona en a largo plazo, movimiento espontáneo no está bien descrita. Monitores de actividad Drosophila (presas) se han utilizado con éxito para controlar el movimiento en el ritmo circadiano de Drosophila estudia ^12,13. Las moscas se colocan en tubos individuales, que se cargan en el DAM. Este aparato está equipado con un sensor de infrarrojos, que cuenta el número de veces que una mosca rompe el haz de luz infrarroja. Estos recuentos se pueden utilizar como una medida de la locomoción y la actividad ^12,13 sin molestias. Mediante la colocación de las moscas en un DAM, el efecto de la rotenona en su locomoción a largo plazo puede ser caracterizado. Este estudio describe los métodos de medición alocomoción y la locomoción espontánea a largo plazo ure corto plazo de sobresalto inducida con el fin de comprender mejor los efectos de la rotenona mediada por deficiencias motoras. Caracterización de las deficiencias de locomoción que imitan la enfermedad de Parkinson son importantes porque permiten el estudio de otros compuestos que pueden revertir estos defectos de locomoción.

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Protocolo

1.-Ensayo de locomoción inducida sobresalto Drosophila

1. Tratamiento de Drogas
   1. Sedate para inmovilizar el número deseado (aproximadamente 8-12) de 1-3 días de edad moscas macho usando CO ₂ y transportarlos a los viales que contengan el alimento suplementado con las drogas. Nota: Otro anestésico por ejemplo, el éter o el hielo puede ser utilizado para sedar a las moscas para permitir el recuento y la manipulación.
   2. Permitir que las moscas para recuperarse de la sedación durante 20 minutos (o hasta que la recuperación) con el vial en posición horizontal (para evitar que las moscas se queda pegada en la comida) y luego coloque el vial en posición vertical en una oscuridad de 12 h, 12 h luz incubadora a 25 ° C para el resto del experimento.
2. Experimental Set Up
   1. Divida esta configuración doble vial en tres secciones iguales de 6,33 cm, marcando círculos alrededor de los viales con un marcador permanente.
   2. Después de 3 días de exposición al fármaco, transferencia vuela sin anestesiar en el vial inferior y colocar rápidamente el vial superiorsobre la abertura. Pegue las dos viales junto con cinta adhesiva transparente.
   3. Permitir que las moscas se aclimaten al nuevo ambiente durante 15 min.
   4. Coloque los viales en un fondo blanco y establecieron una cámara digital a una distancia apropiada del aparato vial doble con un contador de tiempo en la vista. Asegúrese de que el conjunto quede visible en un único marco de imagen y que todas las moscas están en foco. Para mantener marcos consistentes entre los ensayos, marque la ubicación de la cámara y el vial.
3. Ensayo de Movilidad
   1. Claramente mostrar el número de prueba, el tratamiento farmacológico y el cronómetro en vista de la cámara.
   2. Pulse firmemente el aparato vial doble contra la encimera 3 veces y asegurarse de que todas las moscas caen al fondo del vial. Simultáneamente iniciar el temporizador.
   3. Cada 5 segundos durante 1 minuto, toma una foto del aparato. Nota: Como alternativa, un video podría ser capturado y se detuvo a intervalos apropiados para las mediciones.
   4. Permitir que las moscas se recuperen en reposo durante 1 min.
   5. Repetir 2 veces más con el tiempo de recuperación de 1 minuto entre cada ensayo. Nota: Cada aparato debe tomar 5 minutos para completar la recopilación de datos. Mantener fuerza similar de tapping entre los ensayos. Múltiple (al menos 3) aparato puede ser manejado fácilmente de forma simultánea.
4. Análisis de Datos
   1. Revise las imágenes y grabar el número de moscas en cada sección a través del tiempo. Calcular el porcentaje de moscas en cada sección con el tiempo. Notas: repetir todo este procedimiento con las mismas moscas a los 2 o 3 puntos de tiempo de interés, por ejemplo, los días 3, 5, y 7 Si demasiadas moscas mueren durante el experimento es posible ampliar el número juicio original para compensar para la mortalidad. Utilice el análisis estadístico apropiado para comparar los datos.

Ensayo 2. Drosophila espontánea Locomotion

1. Preparación de Alimentos
   1. Reconstituir 3 g de medio Drosophila instantánea con 15 ml de agua desionizada y rotenona deseada(U otro fármaco de interés) dosis.
   2. Una vez que la mezcla de los alimentos se ha convertido en firme (aproximadamente 5 minutos), cargue con cuidado la comida que es de aproximadamente 1 cm de alto en fabricante suministra tubos transparentes (5 mm x 65 mm). Añadir el fármaco infundido alimentos a los tubos colocando cuidadosamente los tubos verticalmente en la comida y torcer hasta que puedan ser retirados con la comida en el interior del tubo. Nota: Es útil colocar un dedo en la abertura del tubo para crear un vacío. Los alimentos no deben contener burbujas de aire o tienen una superficie irregular como las moscas se pueden atascar.
2. Configuración Experimental
   1. Colocar una tapa de plástico sobre el extremo del tubo más próximo a la comida. Empuje la tapa de plástico en el tubo de tan poco como sea posible, ya que puede crear una burbuja de aire en el vial, si se empuja a la fuerza.
   2. Sedate 1 días de edad moscas macho usando CO ₂ e inserte con cuidado 1 macho vuela en cada tubo con un pincel. Repita dependiendo del número de ensayos deseados.
   3. Enchufe elfinal del tubo más alejado de la comida con una pequeña bola de algodón, que se puede enrollar la mano más grande comprados en la tienda de bolas de algodón.
   4. Permitir que las moscas se recuperen con los tubos en posición horizontal durante 15 minutos y asegurarse de que todas las moscas están vivos y activos. Inserte los tubos en DAM y asegúrese de que todos los tubos están en la misma posición respecto a la represa. Nota: Es posible colocar con el área de vigilancia en el centro del vial, o para empujar todos los viales a un lado, de manera que se está supervisando el extremo del tubo. Nota: Véase la discusión para variantes de este método.
3. Recogida de datos
   1. Coloque el DAM en una oscuridad de 12 h, 12 h incubadora luz ajustado a 25 ° C. Conecte el DAM al sistema de recolección de datos. Abra el software DAM y en las preferencias de selección de longitud bin a 10 min. Comienza la recogida de datos y permitir que el programa para recoger datos durante 7 días. Nota: la longitud Bin se puede ajustar si es necesario.
   2. Análisis de Datos
      Nota: Procesolos datos para obtener recuentos por min como una medida para la locomoción espontánea a largo plazo.
      1. Abrir archivos DAM programar y supervisar el acceso de exploración de datos haciendo clic en Seleccionar datos de entrada.
      2. Seleccionar rango apropiado de monitor y seleccione la longitud bin a intervalos de 10 min.
      3. En salida de tipo de archivo, elija Archivos de canal. Deje el resto de opciones por defecto.
      4. Haga clic en los datos de exploración y guardar en una carpeta designada.
      5. Importar datos en un circadiano software de análisis de datos para obtener los recuentos por min. Nota: Para el análisis de datos de software Clocklab es de uso general. Otras opciones están también disponibles.

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Resultados

Ensayo de locomoción inducida por sobresalto Drosophila

Wildtype, Cantón-S, las moscas mostraron una respuesta negativa geotáctico robusto con sólo aproximadamente el 88% y el 5% de las moscas en las secciones superior e inferior, respectivamente, del aparato de doble vial después de 30 segundos (Figura 1). Las moscas expuestas a 125 M y 250 M rotenona durante 3 días mostraron una ligera disminución en el número de moscas en la secc...

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Discusión

En este estudio, se describen dos procedimientos para medir tanto la locomoción espontánea a largo plazo y la locomoción inducida de sobresalto-a corto plazo en un modelo de Drosophila inducida por rotenona de la enfermedad de Parkinson. También se puede medir estas características de locomoción en las moscas expuestas a otros agentes farmacológicos conocidos para modelar la enfermedad de Parkinson, por ejemplo, paraquat ^14, modelos genéticos de la enfermedad de Parkinson, por ej...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5 X 65 mm
Recipe for Rotenone + food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.