のロテノン誘発性のパーキンソン病モデルにおける自発と驚愕誘発性歩行を特徴づけるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em

要約

パーキンソン病は、運動欠陥を引き起こす中枢神経系におけるドーパミン作動性ニューロンの変性に起因する神経変性疾患である。ロテノンモデルショウジョウバエのパーキンソン病。本論文では、ロテノンによって引き起こされる自発的かつ驚愕誘発性の両方歩行の欠陥を特徴づける2つのアッセイの概要を説明します。

要約

パーキンソン病は、主に黒質に、中枢神経系におけるドーパミン作動性ニューロンの変性に起因する神経変性疾患である。疾患は、ヒトにおける剛性、振戦および痴呆として存在モータの欠陥を引き起こす。ロテノンは、ミトコンドリアにおける電子伝達系の機能を阻害することによって、酸化的損傷を引き起こす殺虫剤である。また、 ショウジョウバエにおけるパーキンソン病をモデル化するために使用される。ハエは、びっくりしている時に上向きに登るためにそれらを強いる固有の負の走地性の応答を持っている。それは、ロテノンは、彼らが下向きにタップされた後に登るハエの能力を混乱の早期死亡率と運動の欠陥の原因となることが確立されている。しかし、自発的な運動にロテノンの効果は十分に文書化されていません。この研究は、内ロテノン誘導性の欠陥を特徴付けるために二つ敏感な再現性、高スループットアッセイを概説ショウジョウバエの短期的な驚愕誘発性運動と長期自発運動。これらのアッセイは、好都合に移動欠陥および治療 ​​薬の有効性の他のショウジョウバエモデルを特徴付けるために適合させることができる。

概要

ロコモーションの不備は、パーキンソン病の主な症状であり、主に黒質¹のドーパミン作動性ニューロンの劣化によって引き起こされる。ロテノンは、 ショウジョウバエ ^2-6のパーキンソン運動障害をモデル化するために広く研究されているケトン殺虫剤である。ロテノンは、最終的に細胞死^7を引き起こす酸化的リン酸化経路を遮断することによって酸化的損傷を引き起こす。ドーパミン作動性ニューロンは、主にモータが^2,7を基に化学物質の影響を作り、ロテノン毒性になりやすいです。彼らは遺伝的に扱いやすいですのでハエでパーキンソン病症状を誘導することによって、私たちはより良い病気を理解し、その症状^6,8-11を解決することができます。 ショウジョウバエは維持し、迅速なライフサイクルを持ちやすい、この効果を研究するための優れたモデルを提供します。

いくつかの研究は、ロテノン、短期驚愕誘発性の原因となることが示されているショウジョウバエ毎期ハエにおける歩行欠陥がロテノン補充食品で維持されている、彼らは驚愕^2-6の後に遅い負走地性の応答を示しています。対照トライアル限り迅速にバイアル装置において上向きに登るため彼らの失敗は驚愕誘発性運動欠陥を示すものである。

長期的にロテノンの効果は、自発的な動きがよくショウジョウバエの活動モニター（のDAM）が正常ショウジョウバエ概日リズムの動きを監視するために使用されている。記載^12,13を研究されていない。ハエは、DAMにロードされる個別のチューブ内に配置される。この装置は、ハエが赤外線ビームを遮断回数をカウントする赤外線センサを備えている。これらのカウントは、邪魔されずに移動および活性^12,13の尺度として用いることができる。 DAMでハエを確定すると、長期的な運動に対するロテノンの影響を特徴づけることができる。この研究は、MEASへの方法について説明しますより良いロテノン仲介モーターの欠陥の影響を理解するためにURE短期の驚愕誘発性運動と長期自発運動。彼らはこれらの運動欠陥を逆転し得る他の化合物の研究のために可能にするので、パーキンソン病を模倣運動欠乏症の特性が重要である。

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プロトコル

1 ショウジョウバエ驚愕誘発性歩行アッセイ

1. 薬物治療
   1. CO _2を使用して、1〜3日齢のオスのハエの希望数を（およそ8-12）固定化し、薬剤を補充食品を含むバイアルに輸送することが落ち着いた。注：別の麻酔薬、例えばエーテルまたは氷が計数および取り扱いを可能にするためにハエを鎮静するために使用することができます。
   2. ハエは（食品に付着したばかりハエを防ぐために）水平にバイアルを20分間（またはリカバリまで）、鎮静から回復した後、12時間の暗闇の中で直立バイアルを配置することができ、25℃で12時間の明インキュベーター実験の残りのために。
2. 実験のセットアップ
   1. 油性マジックでバイアルの周りに円をマークすることで、6.33センチメートルの3等分この二重バイアルセットアップを分割します。
   2. 薬物曝露の3日後、転送が底バイアル中に麻酔なしで飛ぶとすぐにバイアルを置く開口部に。明確なテープと一緒に2つのバイアルをテープで固定します。
   3. ハエは15分間、新しい環境に順応できるようにします。
   4. 場所バイアル白地に、ビュー内のタイマによる二重バイアル装置から適切な距離にデジタルカメラを設置。装置全体は、単一の画像フレームで表示され、すべてのハエが焦点になっていることを確認してください。試験間一貫したフレームを維持するために、カメラやバイアルの位置をマーク。
3. モビリティアッセイ
   1. 明らかに、カメラビューに試行番号、薬物治療、タイマーを表示する。
   2. しっかりとカウンターに対する二重バイアル装置を3回タップすると、すべてのハエがバイアルの底に落ちることを確認してください。同時にタイマーを開始。
   3. 1分間ごとに5秒間、装置の写真を撮る。注：または、ビデオがキャプチャされ、測定のための適切な間隔で一時停止することができた。
   4. ハエが1分間邪魔されずに回復することを許可します。
   5. 各試行の間に1分間の回復時間をさらに2回繰り返します。注：各装置は、データ収集を完了するために5分を取るべきである。裁判の間、タッピングの同じような力を維持します。複数（少なくとも3）装置は、容易に同時に取り扱うことができる。
4. データ分析
   1. 写真を確認し、時間をかけて各セクションのハエの数を記録する。時間をかけて各セクションのハエの割合を計算します。注：あまりにも多くのハエは、実験を通して死ぬ場合は、補償するために、元の試行番号をスケールアップすることが可能であり、例えば、関心のある2または3の時点で同一のハエで、この手順全体を繰り返して3日目、5、および7死亡率。データを比較するために、適切な統計分析を使用してください。

2 ショウジョウバエ自発歩行アッセイ

1. 食品の調製
   1. 15脱イオン水mlの希望ロテノンインスタントショウジョウバエ培地の3グラムを再構成（または関心のある別の薬剤）の投与量。
   2. 食品混合物はしっかりした（約5分）となっていたら、慎重にメーカーへの高約1cmを透明のチューブ（5ミリメートル×65 mm）を供給すべき食品をロードします。慎重に食品中に垂直にチューブを配置し、それらがチューブ内の食品を用いて除去することができるまで、それらをねじることによって管に食物を注入された薬剤を追加します。注：これは、真空を作成するために、管の開口部に指を置くと便利です。食べ物は気泡が含まれているか、ハエがままになることがように表面に凹凸があってはなりません。
2. 実験の設定
   1. 食品最寄りのチューブの端部にプラスチックキャップを置きます。強制的にプッシュされた場合、それがバイアル内に気泡を作成することができますよう、可能な限り少ない管上にプラスチックキャップを押してください。
   2. 落ち着いた1日齢の雄は、CO _2を使用して飛行し、慎重に1オスが絵筆を各チューブに飛んで挿入します。所望の試行回数に応じて繰り返す。
   3. プラグ大きな店買ったコットンボールから手をロールバックすることができ、小さなコットンボールを持つ食物からチューブ最も遠い、の終わり。
   4. ハエは15分間水平にチューブを回復し、すべてのハエが生きて、アクティブであることを確認できるようにします。 DAMにチューブを挿入し、すべての管がDAMに対する相対同じ位置にあることを確認してください。注：これは、管の端部が監視されているように、バイアル瓶の中央モニタリングの領域とに配置する、または側面にすべてのバイアルをプッシュすることが可能である。注：この方法のバリエーションのための説明を参照してください。
3. データ収集
   1. 12時間の暗闇の中でDAMを置き、12時間の明インキュベーターを25℃に設定してください。データ収集システムにDAMを接続します。 DAMソフトウェアを開いて、好みの下で10分のビンの長さを選択します。データ収集を開始し、番組が7日間のデータを収集できる。注：必要に応じてビンの長さを調整することができる。
   2. データ分析
      注：プロセスデータは、長期自発運動の尺度として分あたりのカウントを得る。
      1. 選択入力データをクリックして開くDAMファイルスキャンプログラムとアクセスモニタデータ。
      2. 適切なモニターの範囲を選択し、10分間隔にビンの長さを選択します。
      3. 出力ファイル·タイプは、チャネルファイルを選択します。デフォルトとして他のすべてのオプションのままにしておきます。
      4. スキャンデータをクリックして、指定したフォルダに保存します。
      5. 分あたりのカウントを取得するために、概日データ解析ソフトウェアでデータをインポート。注：データ解析Clocklabソフトウェアが一般的に使用されるために。その他のオプションも用意しています。

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結果

ショウジョウバエ驚愕誘発性歩行アッセイ

野生型、 カントン-Sは 、ハエは、30秒（ 図1）の後に二重バイアル装置の、それぞれわずか約88％、上部と下部でのハエの5％堅牢な負走地性の反応を示した。 3日間125μMおよび250μMロテノンにさらさハエは、上部セクションと下部セクションのハエの数がわずかに増加中のハエの数がわず?...

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ディスカッション

本研究では、パーキンソン病のロテノン誘発性ショウジョウバエモデルにおける長期的な自発運動および短期驚愕誘発性運動の両方を測定するための2つの手順を説明します。 Oneはまた、パーキンソン病などをモデル化することが知られている他の薬理学的薬剤、パラコート^14、パーキンソン病などの遺伝的モデルが、α-シヌクレイン変異体^15、

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5 X 65 mm
Recipe for Rotenone + food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.