Métodos para caracterizar espontânea e surpreender-induzida Locomotion em um modelo de doença de Parkinson induzida por Rotenone de<em&gt; Drosophila</em

Resumo

A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa que resulta da degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, causando defeitos de locomoção. Modelos rotenona doença de Parkinson em Drosophila. Este documento descreve dois ensaios que caracterizam as deficiências de locomoção tanto espontâneas e induzidas por assustar causadas por rotenona.

Resumo

A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa que resulta da degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, principalmente na substantia nigra. A doença provoca deficiências motoras, que apresentam como rigidez, tremores e demência em humanos. Rotenone é um inseticida que causa dano oxidativo, inibindo a função da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria. É também usado para modelar a doença de Parkinson na Drosophila. As moscas têm uma resposta geotactic negativa inerente, o que os obriga a subir para cima ao ser assustado. Foi estabelecido que a rotenona causa defeitos de mortalidade e de locomoção primeiros que perturbam a capacidade das moscas para subir depois de terem sido aproveitado para baixo. No entanto, o efeito de rotenona em movimento espontâneo não está bem documentada. Este estudo descreve dois ensaios sensíveis, reprodutíveis e de alto rendimento para caracterizar deficiências induzida por rotenona ema curto prazo de sobressalto-locomoção induzida e locomoção espontânea de longo prazo em Drosophila. Estes ensaios podem ser convenientemente adaptados para caracterizar outros modelos de Drosophila de defeitos de locomoção e a eficácia de agentes terapêuticos.

Introdução

Deficiências de locomoção são um dos principais sintomas de doença de Parkinson e são em grande parte causadas por deterioração dos neurónios dopaminérgicos da substância negra ^1. Rotenone é um inseticida cetônico que tem sido estudado extensivamente para modelar déficits motores de Parkinson em Drosophila ^2-6. Rotenone provoca danos oxidativos, bloqueando a via de fosforilação oxidativa, o que acaba por causar a morte de células ^7. Neurónios dopaminérgicos são mais propensas a toxicidade de rotenona, fazendo com que os efeitos do produto químico principalmente motor baseado ^2,7. Ao induzir sintomas da doença de Parkinson em moscas, podemos entender melhor a doença e seus sintomas remediar ^6,8-11. Drosophila fornece um bom modelo para estudar o efeito, porque eles são geneticamente dócil, de fácil manutenção, e têm um ciclo de vida rápido.

Vários estudos têm mostrado que provoca rotenona induzida por sobressalto de curto prazodefeitos de locomoção em moscas Drosophila -quando são mantidos em alimentos suplementados com rotenona, eles mostram uma resposta mais lenta geotactic negativo após susto ^2-6. Sua incapacidade de subir para cima em um aparelho de frasco tão rapidamente quanto os ensaios de controle é indicativo de defeitos de locomoção induzida pelo sobressalto.

O efeito de rotenona no longo prazo, o movimento espontâneo não está bem descrita. Monitores de actividade de Drosophila (DAMS) têm sido utilizados com sucesso para controlar o movimento em Drosophila ritmo circadiano estuda ^12,13. As moscas são colocadas em tubos individuais, as quais são carregadas para o DAM. Este aparelho é equipado com um sensor de infravermelhos, o qual conta o número de vezes que uma mosca divide o feixe de infravermelhos. Estas contas podem ser utilizados como uma medida de actividade de locomoção e ^12,13 imperturbável. Ao colocar as moscas em um DAM, o efeito de rotenona na sua locomoção de longo prazo pode ser caracterizado. Este estudo descreve métodos para mediçãoure a curto prazo de sobressalto-locomoção induzida e locomoção espontânea de longo prazo, de modo a compreender melhor os efeitos da rotenona mediada deficiências motoras. Caracterização de deficiências de locomoção que imitam a doença de Parkinson são importantes porque permitem o estudo de outros compostos que podem reverter esses defeitos de locomoção.

Protocolo

1 induzida por Startle Drosophila Ensaio locomoção

1. Tratamento de Drogas
   1. Sedate para imobilizar o número desejado (aproximadamente 8-12) de 1-3 dias de idade do sexo masculino voa usando CO ₂ e transportá-los para os frascos que contêm o alimento suplementado com a droga. Nota: Um outro anestésico por exemplo, éter ou gelo podem ser usados ​​para sedar moscas para permitir a contagem e manuseamento.
   2. Permitir moscas para se recuperar de sedação por 20 minutos (ou até que a recuperação), com o frasco em posição horizontal (para evitar moscas ficar preso em alimentos) e em seguida, coloque o frasco na posição vertical em um escuro de 12 h, 12 h luz incubadora a 25 ° C para o resto da experiência.
2. Experimental Set Up
   1. Divida esta configuração frasco duplo em três partes iguais de 6,33 centímetros, marcando círculos em torno dos frascos com um marcador permanente.
   2. Depois de 3 dias de exposição ao fármaco, a transferência voa sem anestesia no frasco de fundo e rapidamente colocar o topo do frascoatravés da abertura. Tape os dois frascos em conjunto com fita adesiva transparente.
   3. Permitir moscas para se aclimatar ao novo ambiente por 15 min.
   4. Coloque os frascos em um fundo branco e configurar uma câmera digital a uma distância adequada do aparelho frasco duplo com um temporizador em vista. Certifique-se de todo o aparelho é visível em um único quadro de imagem e que todas as moscas estão em foco. Para manter quadros consistentes entre ensaios, marcar a localização da câmera e no frasco.
3. Mobility Assay
   1. Claramente exibir o número de teste, o tratamento medicamentoso, e temporizador de visão da câmera.
   2. Bata firmemente o aparelho de frasco duplo contra a bancada 3 vezes e assegurar que todas as moscas cair para o fundo do frasco. Simultaneamente iniciar o temporizador.
   3. A cada 5 segundos para 1 min, tirar uma foto do aparelho. Nota: Como alternativa, um vídeo pode ser capturado e fez uma pausa em intervalos apropriados para medições.
   4. Permitir que as moscas se recuperar em repouso durante 1 minuto.
   5. Repita mais duas vezes com 1 min tempo de recuperação entre cada tentativa. Nota: Cada aparelho deve levar de 5 min para completar a coleta de dados. Manter a força similar de tocar entre ensaios. (Pelo menos três) aparelhos múltipla pode ser facilmente manuseados simultaneamente.
4. Análise de Dados
   1. Veja as fotos e registrar o número de moscas em cada seção ao longo do tempo. Calcula-se a percentagem de moscas em cada secção ao longo do tempo. Notas: Repita esse procedimento inteiro com as mesmas moscas em 2 ou 3 pontos de tempo de interesse, por exemplo, dia 3, 5 e 7 Se muitas moscas morrem durante todo o experimento, é possível ampliar o número de julgamento original para compensar para a mortalidade. Use a análise estatística adequada para comparar os dados.

2. Drosophila espontânea Locomotion Assay

1. Preparação de Alimentos
   1. Reconstituir 3 g de meio de Drosophila instante com 15 ml de água desionizada e rotenona pretendido(Ou outro fármaco de interesse) de dosagem.
   2. Uma vez que a mistura de alimentos tornou-se firme (cerca de 5 minutos), coloque cuidadosamente o alimento a ser de aproximadamente 1 cm de altura em fabricante fornecido tubos transparentes (5 mm X 65 mm). Adicionar o fármaco infundido alimentos para os tubos, colocando cuidadosamente os tubos verticalmente no alimento e torcendo-os até que eles possam ser removidos com o alimento para dentro do tubo. Nota: É útil para colocar um dedo na abertura do tubo, para criar um vácuo. Os alimentos não devem conter quaisquer bolhas de ar ou ter uma superfície irregular, como as moscas podem ficar presos.
2. Configuração Experimental
   1. Colocar uma tampa de plástico na extremidade do tubo mais próximo ao alimento. Empurre a tampa de plástico do tubo tão pouco quanto possível, uma vez que pode criar uma bolha de ar no frasco, se levado a força.
   2. Sedate masculino 1 dia de idade, voa usando CO ₂ e cuidadosamente inserir um homem voar em cada tubo com um pincel. Repetir dependendo do número de ensaios desejados.
   3. Ligue oextremidade do tubo mais distante do alimento com uma bola de algodão pequeno, que pode ser de mão rolou maior loja comprou bolas de algodão.
   4. Permitir moscas para recuperar com os tubos em posição horizontal durante 15 min e assegurar que todas as moscas estão vivos e activos. Inserir os tubos em DAM e certifique-se que todos os tubos estão na mesma posição em relação a barragem. Nota: É possível colocá-los com a área de monitorização no meio do recipiente, ou para apertar todos os frascos para o lado, de modo que a extremidade do tubo está a ser monitorizado. Nota: Veja a discussão de variações sobre este método.
3. Coleta de Dados
   1. Coloque o DAM em um escuro de 12 h, 12 h luz incubadora regulada a 25 ° C. Conecte o DAM para o sistema de coleta de dados. Abra o software DAM e sob preferências selecione comprimento bin para 10 min. Comece a coleta de dados e permitir que o programa para coletar dados durante 7 dias. Nota: comprimento Bin pode ser ajustado, se necessário.
   2. Análise de Dados
      Nota: Processoos dados para se obter contagens por min como uma medida para a locomoção espontânea de longo prazo.
      1. Arquivo DAM abrir o programa e monitorar o acesso de digitalização de dados, clicando em dados de entrada selecionados.
      2. Selecione a faixa de monitor apropriado e selecione comprimento bin para intervalos de 10 minutos.
      3. Em tipo de arquivo de saída escolher arquivos do canal. Deixe todas as outras opções como padrão.
      4. Clique dados de digitalização e salvar em uma pasta designada.
      5. Importar dados em um software de análise de dados circadiano obter contagens por min. Nota: Para a análise dos dados software Clocklab é comumente usado. Outras opções também estão disponíveis.

Resultados

Induzida por Startle Drosophila Ensaio locomoção

De tipo selvagem, Canton-S, as moscas apresentaram uma resposta negativa geotactic robusta com apenas cerca de 88% e 5% das moscas nas partes superior e inferior, respectivamente, do aparelho duplo frasco após 30 segundos (Figura 1). Moscas expostos a 125 mM e 250 mM rotenone por 3 dias apresentaram um ligeiro decréscimo no número de moscas na parte superior e ligeiro aumento no número ...

Discussão

Neste estudo, são descritos dois procedimentos para medir tanto a locomoção espontânea a longo prazo e a locomoção induzida pelo sobressalto a curto prazo num modelo de doença de Parkinson induzida por Drosophila rotenona. Pode-se também medir essas características de locomoção em moscas expostas a outros agentes farmacológicos conhecidos para modelar a doença de Parkinson, por exemplo, paraquat ^14, modelos genéticos da doença de Parkinson, por exemplo, alfa-sinucleí...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5 X 65 mm
Recipe for Rotenone + food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.