Yöntem Spontan Karakterizasyonu Ürkütme kaynaklı hareket yeteneği bir Rotenon ile uyarılan Parkinson Hastalığı Modeli için<em&gt; Drosophila</em

Özet

Parkinson hastalığı hareket yeteneği etkilere neden, merkezi sinir sistemindeki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ile sonuçlanan bir nörodejeneratif hastalıktır. Rotenon modelleri Drosophila Parkinson hastalığı bulunmaktadır. Bu kağıt rotenone neden spontan ve irkilme-kaynaklı hem lokomosyon eksiklikleri niteleyen iki deneyleri özetliyor.

Özet

Parkinson hastalığı esas olarak, substantia nigra merkezi sinir sistemindeki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ile sonuçlanan bir nörodejeneratif hastalıktır. Hastalık insanlarda katılık, titreme ve demans gibi sunmak motorlu eksiklikleri neden olur. Rotenon mitokondrideki elektron taşıma zincirinin işlevini inhibe ederek oksidatif hasara neden olan bir insektisit olan. Ayrıca, Drosophila Parkinson hastalığı modeli kullanılır. Sinekler onları şaşırtan geçtikten sonra yukarı tırmanmaya zorlayan içsel bir negatif geotactic yanıtı var. Bu rrotenon onlar aşağı dinlendiğini sonra tırmanmaya sineklerin yeteneğini bozabilir erken mortalite ve hareket kusurlarına neden olduğu tespit edilmiştir. Ancak, spontan hareketi rotenone etkisi iyi belgelenmiş değildir. Bu çalışma, rotenon kaynaklı eksiklikleri karakterize etmek için, iki, hassas, tekrarlanabilir ve kapsamlı incelemeler özetlenmektedirKısa vadeli Drosophila lokomosyon ve uzun vadeli spontane hareketlilik irkilme kaynaklı. Bu deneyler, uygun bir hareket yeteneği kusurları ve terapötik maddelerin etkinliğinin diğer Drosophila modelleri karakterize adapte edilebilir.

Giriş

Lokomosyon eksiklikler Parkinson hastalığının büyük bir semptomudur ve büyük ölçüde, substantia nigra ¹ dopaminerjik nöronların bozulmasına neden olur. Rotenon Drosophila ^2-6 Parkinson motor açıkları modellemek için yoğun şekilde çalışılmış bir ketonik bir böcek öldürücüdür. Rotenon sonuçta hücre ölümüne ⁷ neden oksidatif fosforilasyon yolu bloke ederek oksidatif hasara neden olur. Dopaminerjik nöronlar, esas olarak, motor ^2,7 göre kimyasal etkiler yaratmak, rotenon zehirlenmesine karşı daha eğilimlidir. Sinekler Parkinson hastalığı belirtileri uyararak, biz daha iyi hastalığı anlamak ve ^6,8-11. Drosophila bakımı kolay, genetik uysal çünkü bu etkiyi incelemek için iyi bir model sağlamaktadır belirtilerini düzeltmek ve hızlı bir yaşam döngüsüne sahip olabilir.

Çeşitli çalışmalarda rotenon kısa süreli irkilme kaynaklı yol açtığını göstermiştirDrosophila'nın -zaman sinekler lokomosyon kusurlar rrotenon-takviye gıda muhafaza, bunlar irkilme ^2-6 sonra daha yavaş bir olumsuz geotactic tepki gösterir. Kontrol denemelerinde olduğu kadar çabuk bir şişe aparatı yukarı tırmanmak için başarısızlık irkilme-kaynaklı lokomosyon kusurları göstergesidir.

Uzun vadede rotenone etkisi, kendiliğinden hareket de Drosophila etkinliği izler (DAMs) başarıyla Drosophila sirkadiyen ritim hareketini izlemek için kullanılır olmuştur. Tarif ^12,13 inceler değildir. Sinekler DAM yüklenen bireysel tüpler içine yerleştirilir. Bu cihaz, bir sinek kızılötesi ışını kırar kez sayar bir kızılötesi sensörü ile donatılmıştır. Bu sayımlar rahatsız hareketlilik ve aktivite ^12,13 bir ölçüsü olarak kullanılabilir. Bir DAM sinek koyarak, onların uzun vadeli lokomosyon rotenone etkisi karakterize edilebilir. Bu çalışma, ölçüm için yöntemler anlatılmaktadırure kısa vadeli iyi rrotenon aracılı motorlu eksikliklerin etkilerini anlamak için hareketlilik ve uzun vadeli spontan lokomosyonu irkilme kaynaklı. Bunlar, bu kusurlar lokomosyon tersi diğer bileşiklerin çalışmaya izin vermesi nedeniyle, Parkinson hastalığının taklit lokomosyon eksiklikleri karakterizasyonu önemlidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Drosophila irkilme kaynaklı Locomotion Deneyi

1. İlaç Tedavisi
   1. Istenilen sayıda hareketsiz için oturaklı (yaklaşık 8-12) 1-3 günlük erkek CO ₂ kullanarak ve ilaç takviyesi gıda içeren flakon taşırlar uçar. Not: Başka bir anestetik, örneğin, eter veya buz sayım ve kontrol edilebilmesi için sakinleştirici sinekleri için kullanılabilir.
   2. 25 ° C'de sinekler (sinekler önlemek için gıda saplanıyor) yatay konumda göz ile 20 dakika (ya da kurtarma kadar) sedasyon kurtarmak ve daha sonra 12 saat karanlıkta dik şişeyi yerleştirmek için izin, 12 saat ışık inkübatör Deneyin geri kalan bölümü için.
2. Deney Kurma
   1. Kalıcı bir kalem ile şişelere etrafında daireler işaretleyerek 6.33 cm olmak üzere üç eşit parçaya bu çifte flakon kurulumu bölün.
   2. Ilaç maruziyeti 3 gün sonra, buraya, alt şişenin içine anestezi olmadan uçar ve hızlı bir şekilde üst şişe yerleştirinaçıklık boyunca yerleştirilir. Şeffaf bir bantla birlikte iki şişe bantlayın.
   3. Sinekler 15 dakika boyunca yeni ortamına alışmaları için izin verin.
   4. Yer beyaz bir arka plan üzerinde küçük şişeler ve görünümünde bir zamanlayıcı ile çift şişe cihazdan uygun bir mesafede bir dijital kamera kurmak. Bütün cihaz tek bir resim çerçevesi görünür olduğundan emin olun ve tüm sinekler odak olduğunu. Çalışmalar arasında tutarlı kareleri korumak için, kamera ve flakonun konumunu işaretleyin.
3. Hareketlilik Deney
   1. Açıkçası kamera görüntüsü deneme sayısını, ilaç tedavisi ve zamanlayıcı gösterilecek.
   2. Sıkıca tezgah karşı 3 kez çift şişe aparatı dokunun ve tüm sinekler şişenin dibine düşer emin olun. Eşzamanlı sayacını başlatmak.
   3. Her 5 saniye ila 1 dakika boyunca, tertibatın bir resim alır. Not: Alternatif olarak, video yakalanan ve ölçümler için uygun aralıklarla durdurulmuş olabilir.
   4. Sinekler 1 dakika boyunca rahatsız kurtarmak için izin verin.
   5. Her deneme arasında 1 dakikalık iyileşme süresi ile 2 kez daha tekrarlayın. Not: Her bir cihaz veri toplama tamamlamak için 5 dakika almalıdır. Çalışmalar arasındaki dokunarak benzer güce sahip. Birden fazla (en az 3) Cihaz kolay olarak ele alınabilir.
4. Veri Analizi
   1. Resimlere ve zamanla her bölümde sinek sayısını kaydedin. Zamanla her bölümde sinek yüzdesini hesaplayın. Notlar: Örneğin, gün 3, 5 için, ilgi 2 veya 3 kez noktalarında aynı sinekler ile tüm bu prosedürü tekrarlayın ve çok sinek telafi etmek için orijinal deneme sayısını büyütmek mümkün olduğu deney boyunca ölmek 7. Eğer mortalite için. Verileri karşılaştırmak için uygun istatistiksel analiz kullanın.

2. Drosophila spontane hareketlilik deneyi

1. Gıda Hazırlama
   1. 15 deiyonize ml su ve arzu edilen rotenone anlık Drosophila orta 3 g sulandırın(Veya ilgi başka bir ilaç) doz.
   2. Gıda karışım firma (yaklaşık 5 dakika) hale geldikten sonra, dikkatlice üreticisi haline yüksek yaklaşık 1 cm şeffaf borular (5 mm X 65 mm) verilen olmak için gıda yükleyin. Dikkatli bir gıda dikey olarak yerleştirilmesi ve tüpler olarak, boru içindeki gıda ile temizlenebilir kadar bunları bükerek tüplerine gıda infüzyon ilacı ekleyin. Not: Bu bir vakum oluşturmak için tüpün ağzına bir parmak yerleştirmek yararlı olur. Gıda hava kabarcıkları içeren ya da sinekler gibi sıkıştığında, düzensiz bir yüzeye sahip olmamalıdır.
2. Deneysel Kurulum
   1. Gıda yakın tüp ucunda bir plastik kap yerleştirin. Zorla itti eğer şişe içinde bir hava kabarcığı oluşturabilir gibi, mümkün olduğunca az tüp üzerindeki plastik kapağı itin.
   2. Oturaklı 1 günlük erkek CO ₂ kullanarak ve dikkatli 1 erkek bir fırça ile her bir tüp içine sinek takın uçar. İstenen denemelerin sayısına bağlı olarak tekrarlayın.
   3. TakEl büyük deposundan rulo olabilir, küçük bir pamuk ile gıda tüp en uzak, sonu pamuk topları aldım.
   4. Sinekler 15 dakika boyunca yatay konumda tüpleri ile kurtarmak ve tüm sinekler canlı ve aktif olmasını sağlamak için izin verin. DAM içine tüpleri yerleştirin ve tüm tüpler DAM için aynı konuma olduğundan emin olun. Not: Bu, şişenin ortasında izleme alanı ile yerleştirmek için, veya borunun ucu, izlenmekte olan, böylece tarafında tüm şişeleri itmek mümkündür. Not: Bu yöntem üzerinde varyasyonlar için tartışma bakın.
3. Veri Toplama
   1. 12 saat karanlıkta DAM yerleştirin, 12 saat ışık inkübatör 25 ° C'ye ayarlanır. Veri toplama sistemine DAM bağlayın. DAM yazılımını açın ve tercihleri ​​seçin bin uzunluğu altında 10 dakika. Veri toplama başlatın ve programı 7 gün boyunca veri toplamak için izin verir. Not: gerekirse kutusu uzunluğu ayarlanabilir.
   2. Veri Analizi
      Not: SüreçVeri uzun süreli spontane hareketlilik için bir ölçüt olarak dakika başına sayımları elde edildi.
      1. Belirleyin giriş verilerini açık tıklayarak BARAJI dosya tarama programı ve erişim monitör verileri.
      2. Uygun monitör aralığını seçin ve 10 dk aralıklarla bin uzunluğunu seçin.
      3. Çıktı dosya türü içinde kanal dosyaları seçebilirsiniz. Varsayılan olarak, tüm diğer seçenekleri bırakın.
      4. Tarama verilerini tıklayın ve belirli bir klasöre kaydedebilirsiniz.
      5. Sirkadiyen veri analizi yazılımı ithalat verileri dakika başına sayıları elde etmek. Not: Veri analizi Clocklab yazılım yaygın olarak kullanılır için. Diğer seçenekleri de mevcuttur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Drosophila irkilme kaynaklı Locomotion Deneyi

Yabani tip, kanton S, sinekler 30 sn (Şekil 1) sonra çift flakon tertibatının, sadece sırasıyla yaklaşık% 88 ve üst ve alt bölümlerinde sinekler% 5 güçlü bir negatif geotactic tepki gösterdi. 125 mcM ve 3 gün boyunca 250 mcM rotenone maruz sinekler üst bölümde ve alt kısmında sinek sayısında hafif bir artış sinek sayısında hafif bir azalma gösterdi. 500 ıLl rotenone...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada, Parkinson hastalığı ile indüklenen Drosophila rotenon modelinde uzun süreli spontane hareketlilik ve kısa süreli irkilme kaynaklı hareketlilik iki ölçüm için iki prosedürleri tarif eder. Bir de, Parkinson hastalığı, örneğin modellemek için bilinen diğer farmakolojik ajanlar, parakuat ^14, Parkinson hastalığı, örneğin genetik modelleri, alfa-sinüklein mutantlar ^15, ve hareketlilikte bir etkileyen hastalıklar ve d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5 X 65 mm
Recipe for Rotenone + food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.