Методы для характеристики Спонтанное и Впечатлите вызванной Locomotion в Ротенон вызванной болезнью Паркинсона модели<em&gt; Drosophila</em

Резюме

Болезнь Паркинсона представляет собой нейродегенеративное расстройство, которое возникает в результате дегенерации допаминергических нейронов в центральной нервной системе, в результате чего передвижения, дефекты. Модели Ротенон болезнь Паркинсона у дрозофилы. В настоящем документе излагаются два анализов, которые характеризуют как спонтанные и поразить индуцированные недостатки передвижения, вызванные ротенона.

Аннотация

Болезнь Паркинсона представляет собой нейродегенеративное расстройство, которое возникает в результате дегенерации допаминергических нейронов в центральной нервной системе, прежде всего, в черной субстанции. Болезнь вызывает двигательные недостатки, которые представляют как жесткость, тремор и деменции у людей. Ротенон является инсектицид, который вызывает окислительное повреждение путем ингибирования функции электрон-транспортной цепи в митохондриях. Он также используется для моделирования болезни Паркинсона в дрозофилы. Мухи имеют неотъемлемое негативное geotactic ответ, который заставляет их подняться вверх на время вздрогнул. Было установлено, что ротенон вызывает ранней смертности и передвижения, дефекты, которые нарушают способность мух, чтобы подняться после того как они были постучал вниз. Тем не менее, влияние ротеноном на спонтанное движение не очень хорошо документированы. Это исследование описывает два чувствительные, воспроизводимые, и высокой пропускной анализов охарактеризовать недостатки Ротенон индуцированных вкраткосрочный испуга, вызванного передвижения и долгосрочный спонтанное передвижение у дрозофилы. Эти анализы могут быть легко адаптированы для характеристики других моделей Drosophila передвижения дефектов и эффективности терапевтических агентов.

Введение

Недостатки локомоции являются основным симптомом болезни Паркинсона и в значительной степени вызвано ухудшением дофаминергических нейронов черной субстанции ^1. Ротенон является кетоновая инсектицид, который хорошо изучена для моделирования дефицита моторных Паркинсона в Drosophila ^2-6. Ротенон вызывает окислительное повреждение, блокируя окислительного фосфорилирования путь, который в конечном итоге приводит к гибели клеток ^7. Дофаминергических нейронов, более склонны к ротенона токсичности, что делает последствия химической первую очередь двигатель на основе ^2,7. По индукции симптомы болезни Паркинсона у мух, мы можем лучше понять болезнь и устранить ее симптомы ^6,8-11. Drosophila представляет собой хорошую модель для изучения этого эффекта, потому что они генетически сговорчивым, просты в обслуживании, и есть быстрый жизненный цикл.

Несколько исследований показали, что ротенон вызывает кратковременное испуга, вызванногопередвижение дефекты Drosophila -Когда мух ведутся на ротенона-дополняется пищи, они показывают медленнее негативное geotactic ответ после испуга ^2-6. Их неспособность подняться вверх в флаконе аппарата так быстро, как испытаний контрольных свидетельствует о испуга, вызванного локомоции дефектов.

Эффект ротенона на долгосрочной перспективе, спонтанное движение не очень хорошо описано. Мониторы Drosophila деятельности (плотин) успешно используются для контроля движения в Drosophila циркадный ритм изучает ^12,13. Мухи помещаются в отдельные пробирки, которые загружаются в РСВ. Этот аппарат оснащен инфракрасным сенсором, который подсчитывает количество раз муха пробитием инфракрасный луч. Эти отсчеты могут быть использованы в качестве меры невозмущенного движения и активности ^12,13. Размещая мух в плотине, эффект ротенона на их долгосрочной передвижения можно охарактеризовать. Это исследование описывает методы в МПСЮр краткосрочный испуга, вызванного передвижения и долгосрочный спонтанное передвижение для того, чтобы лучше понять последствия Ротенон опосредованной недостатков двигателя. Характеристика опорно-двигательного недостатков, имитирующих болезнь Паркинсона важны, поскольку они позволяют для изучения других соединений, которые могут повернуть вспять эти передвижения, дефекты.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1 Drosophila испуга, вызванного Передвижение Анализ

1. Лечение наркотиками
   1. Sedate для иммобилизации желаемого количества (примерно 8-12) из 1-3 день-летний мужчина летит с помощью CO ₂ и перевезти их в пробирки, содержащие пищу наркотиков дополняется. Примечание: Еще один анестетик, например, простой эфир или льда может быть использован, чтобы успокоить мух, чтобы позволить подсчета и обработки.
   2. Разрешить мухи для восстановления после седации в течение 20 мин (или до восстановления) с флакона в горизонтальном положении (чтобы предотвратить застревание мух на продукты питания), а затем поместить флакон в вертикальном положении в течение 12 ч темноты, свет 12 ч инкубаторе при 25 ° C на оставшуюся часть эксперимента.
2. Экспериментальная установка
   1. Разделите эту двойную флакон установки на три равные разделах 6,33 см, пометив круги вокруг флаконов с постоянным маркером.
   2. После 3 дней воздействия лекарственного средства, передача летит без анестезии в нижнюю флакона и быстро разместить верхнюю флаконнад отверстием. Лента двух флаконов вместе с ясной лентой.
   3. Разрешить мухи, чтобы акклиматизироваться к новым условиям в течение 15 мин.
   4. Место флаконов на белом фоне и настроить цифровую камеру на соответствующем расстоянии от двойной флакона аппарата с таймером в поле зрения. Убедитесь, весь аппарат видна в одном фоторамку и что все мухи находятся в фокусе. Для поддержания согласованных кадры между испытаний, отметьте расположение камеры и флакона.
3. Мобильность Анализ
   1. Очевидно отображения тройственное число, медикаментозное лечение, и таймер в поле зрения камеры.
   2. Плотно нажмите на двойную флакон аппарат по отношению к столешнице 3 раза, и обеспечить, чтобы все мухи падают на дно флакона. Одновременно запустить таймер.
   3. Каждый 5 сек в течение 1 мин, сфотографировать аппарата. Примечание: В качестве альтернативы, видео могут быть захвачены и остановился через соответствующие промежутки времени для измерений.
   4. Разрешить мухи восстановить в покое на 1 мин.
   5. Повторите еще 2 раза с 1 мин время восстановления между каждым испытанием. Примечание: Каждый аппарат должен принять 5 мин, чтобы завершить сбор данных. Поддерживать подобный силу нажатия между испытаниями. Несколько (по крайней мере, 3) устройство может быть легко обрабатываются одновременно.
4. Анализ данных
   1. Просмотрите фотографии и записывать количество мух в каждой секции с течением времени. Вычислить процент мух в каждой секции с течением времени. Примечания: Повторите всю процедуру с теми же мух в 2 или 3 временных точек интереса, например, день 3, 5, и 7 Если слишком много мух умирают в течение всего эксперимента, то можно масштабировать до оригинального тройственное число, чтобы компенсировать для смертности. Используйте соответствующий статистический анализ, чтобы сравнить данные.

Анализ 2 Drosophila Спонтанное Передвижение

1. Приготовление пищи
   1. Восстановить 3 г быстрорастворимого Drosophila среды с 15 мл деионизированной воды и желаемой ротенона(Или другой препарат интерес) дозировка.
   2. Как только еда смесь стала фирма (около 5 мин), тщательно загрузить, что еда была примерно 1 см в высоту в производителя поставляются прозрачные трубки (5 мм X 65 мм). Добавить препарат настоянный еду в пробирки, тщательно помещая пробирки вертикально в пищу и, поворачивая их, пока они не могут быть удалены с едой внутри трубки. Примечание: Это полезно поместить палец на открытии трубки для создания вакуума. Пища не должна содержать пузырьки воздуха или имеют неровную поверхность, как мухи может застрять.
2. Экспериментальная установка
   1. Поместите пластиковую крышку на конце трубки ближайшего еде. Нажмите пластиковый колпачок на тюбике как можно меньше, так как это может создать воздушный пузырь во флаконе, если толкнул насильно.
   2. Sedate 1 день-летний мужчина летит с помощью CO ₂ и осторожно вставьте 1 мужчина летать в каждую пробирку с кисти. Повторите в зависимости от количества требуемых испытаний.
   3. ПодключитеКонец трубки дальней от пищи с небольшим ватным тампоном, которые могут быть стороны проката из большего хранилища купил ватные шарики.
   4. Разрешить мухи, чтобы восстановить с трубками в горизонтальном положении в течение 15 мин и обеспечить, чтобы все мухи живы и активны. Вставьте трубки в РСВ и убедитесь, что все трубки находятся в том же положении по отношению к плотине. Примечание: Можно поместить их в области мониторинга в середине флакона, или нажать все флаконы в сторону, так, чтобы конец трубки находится под контролем. Примечание: Смотрите обсуждение для вариации этого метода.
3. Сбор данных
   1. Поместите DAM в 12 час темноте, 12 ч света инкубатор установлен на 25 ° C. Подключите DAM к системе сбора данных. Откройте программу DAM и под предпочтений Выберите длину бен 10 мин. Начните сбор данных и запустить программу для сбора данных в течение 7 дней. Примечание: длина Bin можно регулировать при необходимости.
   2. Анализ данных
      Примечание: Процессданные для получения импульсов в мин в качестве меры для долгосрочного спонтанного передвижения.
      1. Открыть файл DAM сканирования программ и монитор для доступа к данным, нажав выберите входные данные.
      2. Выберите соответствующий диапазон монитора и выберите длину бен к 10-минутные интервалы.
      3. В выходной типа файла выбрать файлы каналов. Оставьте все другие варианты, как по умолчанию.
      4. Нажмите данные сканирования и сохранения в указанную папку.
      5. Импорт данных в циркадных программного обеспечения для анализа данных для получения импульсов в мин. Примечание: Для анализа данных Clocklab программное обеспечение обычно используется. Другие опции также доступны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Drosophila испуга, вызванного Передвижение Анализ

Дикого типа, Canton-S, мухи показал надежную негативное geotactic ответ с только приблизительно 88% и 5% от мух в верхней и нижней секций соответственно, аппарата двойной флакон через 30 сек (Рисунок 1). Мухи по?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании, мы опишем две процедуры измерения как долгосрочный спонтанное передвижение и краткосрочный испуга, вызванного передвижения в ротенона вызванной Drosophila модели болезни Паркинсона. Наконец, можно оценить эти передвижения, характеристики в мух, подверженных дру?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5 X 65 mm
Recipe for Rotenone + food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.