研究DNA环接了单分子荧光共振能量转移

摘要

这项研究提出了一个详细的实验步骤，使用单分子荧光共振能量转移（FRET）来衡量的双链DNA循环动力学。该协议还描述了如何提取称为歼因子循环概率密度。

摘要

弯曲的双链DNA（dsDNA）的是与许多重要的生物学过程，如DNA-蛋白质识别和DNA包装成核小体相关联。双链DNA弯曲的热力学研究了它依赖于DNA连接酶共价连接一个双链DNA的短粘性末端的方法称为环化。然而，连接效率可受许多不相关的双链DNA循环如围绕接合的粘性末端的DNA结构，和连接酶的因素也可以通过诸如非特异性结合的影响明显的循环速率。在这里，我们将展示如何通过检测瞬态DNA环的形成由FRET（荧光共振能量转移）来衡量双链DNA循环动力学无连接酶。双链DNA分子使用的是简单的基于PCR的协议与FRET对和生物素连接器构成。称为歼因子的循环概率密度是从两个断路之间的循环速率和退火速率提取特德粘性末端。通过测试2 dsDNAs具有不同本征曲率，我们表明，歼因子是对双链DNA的固有形状敏感。

引言

了解双链DNA的力学性能是极为重要的基础科学和工程应用。双链DNA的结构比直螺旋阶梯更加复杂，因为连续的碱基对之间滚动，倾斜和扭转角可以与序列有所不同。热波动可能会导致双链DNA，以进行构象波动的不同模式，如弯曲，扭转和伸展。过渡，例如熔化和扭结，也可能发生在极端条件下。

在这些议案，双链DNA弯曲有最明显的生物学影响^1。双链DNA弯曲与基因抑制或激活通过将两个遥远接近彼此关联。它也起着在细胞核内的DNA包装或病毒衣壳中起重要作用。双链DNA的弯曲变形可以通过实验由高分辨率显微镜（AFM ²和TEM ^3），以及thermodyn进行可视化AMICS和动力学可以通过循环检测，其化学连接的双链DNA并列的网站进行研究。

一个这样的实验是连接酶依赖的环化^4。在该试验中，双链DNA分子的"粘性"（聚）端部发送或通过DNA连接酶二聚化。通过比较圆和二聚物的形成速率，可以得到在其另一端，这是已知的歼因子附近的DNA的一端的有效摩尔浓度。这j数目是二维等价​​于求该DNA的一端从另一端，在短距离的概率密度，从而反映了DNA的灵活性。测量歼因子的DNA长度的函数揭示了DNA的机制包括持续长度^4,5诸多特点。

该蠕虫状链（WLC）模型已被广泛认为是基于其在expla成功双链DNA力学的规范聚合物模型伊宁DNA的拉动实验^6，正确预测dsDNAs的歼因素大于200 bp的⁷所得到的力-延伸曲线。但是，使用双链DNA上的分子越短100 bp的环化法，克卢捷和Widom测量歼因素是几个数量级比WLC模型预测高^8。一年后，杜等人 。生产Ĵ因素与使用环化检测与低连接酶的浓度在WLC模型协议，并归因于异常结果从Widom组用⁹高连接酶的浓度。使用传统的分析⁹时，这场争论体现了DNA连接酶环化上动力学不可避免的影响。此外，DNA连接酶还可以通过非特异性结合^10,11影响DNA结构和刚度。

为了消除蛋白依赖的循环试验的技术问题，我们最近展示了普罗特基于荧光共振能量转移^（FRET）12 EIN自由循环试验。在该方法中，环的构象是通过FRET附近的DNA分子的粘性末端的供体和受体之间进行检测。客观型全内反射荧光显微镜（TIRFM）是用来记录可逆循环，并从表面固定的单个DNA分子为长时间unlooping事件的轨迹。此方法具有的DNA分子的PCR为基础的组件以产生错配的游离DNA分子，这是通过由Vafabakhsh和哈¹³类似的方法的一个关键的改进。此协议的单分子方面允许除了分布测量到总体均值而FRET方面允许一个反复从同一分子测定DNA循环动力学，甚至在可能损害连接酶活性的条件。

该TIRFM设置如图1。自定义设计的样品载物台放置在奥林巴斯IX61显微镜体。 532纳米和640纳米激光器从侧面引入并通过微小的椭圆镜¹⁴进入高NA物镜被反射来实现入射临界角在盖玻片-水界面。我们注意到，更广泛地通过目标使用二向色反射镜或棱镜型TIR TIR设置也可用于本申请FRET。由显微镜所形成的荧光图像通过分色镜分成供体和受体的图像。然后将它们重新成像到一个EMCCD的两半。附加的长通发射滤波器被用于减少背景信号。

温度控制是获得可重复的动力学数据是必不可少的。对于温度控制，目标是从镜身，以减少热传递，并从温度控制冷却器/加热器水的分离物镜转换器通过一个黄铜项圈紧密配合循环围绕目标外套下的内部金属。这种设置能够实现强大的温度控制在（ 图2），15至50℃的盖玻片表面。在这项工作中，将样品的温度保持在24℃。

以下协议给出了一步一步的过程进行DNA施工，估计DNA的形状，单分子实验，和J的因素决定。

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研究方案

1，双链DNA样品制备

1. 通过重复10个碱基序列设计全局弯曲的DNA。例如，5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - （TTTATCATCCTTTATCATCC 倍 _）7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3'是一个186-bp的DNA弯曲，其中X是一个随机额外的碱和序列侧翼的重复10 -聚体序列的接头序列。
   注意:在这个例子中两个10聚体与基于由Kaplan 等大规模的核小体占据的研究相反的喜好来核小体形成¹⁵被选中。由于双链DNA的螺旋重复接近10基点的10 -聚体的螺旋轴的任何净挠度会积累，产生类似的圆弧（ 图3A）的形状。由于螺旋周期为越接近10.5沸点，一个额外的基底被插入每两个重复序列后，以保持弯曲的结构的平面成为可能。这些序列大于200 bp的短可以从companie订购s表示提供基因合成服务。是很方便的侧翼这些序列与用于后续步骤中共同接头序列。该程序是图式在图3B中。
2. 用引物1（GTGCCAGCAACAGATAGC）和引物2（/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG）进行PCR。注:引物2被标记的FRET供体Cy3标记的5'末端。一个典型的PCR配方和骑自行车的协议列于表1和表2。
3. 用引物3（/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC）和引物4（CAACAACGAGCTCGAATG）进行PCR。注:引物3被标记通过骨干和生物素 - 接头在5'端的FRET受体的Cy5。 PCR技术配方和骑自行车的协议如上。
4. 使用PCR净化试剂盒纯化PCR产物。
5. 以最终浓度为0.4和混合在一个缓冲区链交换（100mM的氯化钠，10mM的Tris-盐酸的pH 7.0,1 mM EDTA）中的Cy3标记产物和Cy5标记产物＃181，M和0.1微米。注意:过量的Cy3-DNA增加了双面同时携带Cy3和Cy5的浓度为链交换的结果。
6. 通过在98.5℃下培养2分钟交换链，逐渐冷却到5 ℃，0.1℃/秒的升温速率，并温育5   °下加热2小时。

2，凝胶电泳来检测双链DNA曲率

1. 通过将丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液在29.2:0.8比例倒入聚丙烯酰胺凝胶^{16,17，5％（}重量/体积）在1X的Tris /硼酸/ EDTA（TBE）缓冲液，pH 8.0。注:10的凝胶溶液包含:1.217毫升40％的丙烯酰胺，0.667毫升2％双丙烯酰胺，加入1ml TBE 10X，100升的过硫酸铵（APS），10％，10升TEMED，其余的是DH ₂ O。凝胶的充分固化需要大约30分钟。
2. 加载聚丙烯酰胺凝胶用DNA样品和在1X上样缓冲液的DNA梯状条带（5％甘油，0.03％（重量/体积）溴酚BLUE），并在5-8运行凝胶V / cm时，在4℃下进行45分钟，或直至染料前沿接近凝胶的末端。
3. 使用1×TBE缓冲液包含0.5克/毫升的溴化乙锭进行30分钟染色的凝胶。确定在紫外光照射下的DNA条带。比较频带位置与大小标记（100 bp的DNA梯状条带）来计算DNA分子的表观体积。注:弯的DNA通常比移动笔直的DNA慢。

3，流通池准备

1. 钻6-7对孔沿载玻片用钻床和金刚石钻头的两个相对的边缘（3'×1'）。钻孔后，擦在流水，除去可见的玻璃粉末的幻灯片。注:孔作为灌注入口和出口。在钻井过程中，冷却水的滑动是非常重要的，以防止开裂。
2. 将玻片直立在一个玻璃罐子，装满水。超声处理15分钟，然后将其转移到另一个玻璃瓶德dicated丙酮清洗。它用丙酮进行超声波处理15分钟，加满。用一个喷雾瓶，然后用清水冲洗，用乙醇的幻灯片。将它们放置在聚丙烯罐，用5个M氢氧化钾填写，超声15分钟。最后，超声处理在水中载玻片15分钟。使用相同的协议清洁的盖玻片（第1号，24×40毫米）。注意:清洗载玻片和盖玻片可以存储在DH _{2 O}长期使用。
3. 拌1毫克生物素-PEG-硅烷（分子量3400）与80毫克的mPEG-硅烷（分子量2000）在340升0.1M碳酸氢钠溶液中。搅拌均匀，离心混合物短暂地摆脱泡沫。注意:用聚乙二醇（PEG）表面的官能化有助于减少DNA与表面的非特异性结合。
4. 把80升的PEG溶液的每张幻灯片上，并轻轻地放下盖玻片了它。等待45分钟。从幻灯片用镊子分开盖玻片，用DH _{2 O}的丰富量冲洗，并令t下摆干在露天。
5. 把细条双面胶带穿过滑动，以形成通道。对齐盖玻片过它，并用力按下盖玻片对滑动，形成液体密封通道。使用5分钟环氧树脂密封的通道的边缘。

4制备水溶性维生素E的解决方案

1. 放〜30毫克Trolox的和10ml DH _{2 O}中的烧瓶中，并使用一个磁铁搅拌棒搅拌该溶液在开放的空气中18小时。
2. 使用0.2微米的过滤器过滤该溶液，并通过添加〜6微升的1M Tris碱（pH为11），将pH调节至7。注意:Trolox的是抗闪烁试剂也就是通常在单分子用于研究^18。 Trolox的的抗褪色作用来源于其氧化衍生物，其存在于部分降解的Trolox的溶液^19。由于低效的氧化，在甲醇或高pH的Tris溶液迅速溶解Trolox的，应该避免。

5，单摩尔ecule成像

1. 注射15微升的NeutrAvidin溶液（0.5毫克/毫升）进入通道，并等待2分钟，加入100μlT50缓冲液（10mM的Tris-HCl，50 mM氯化钠，pH 7.0）中漂洗之前。
2. 注入50μl的DNA样品（50-PM）的进入通道。等待5分钟，用100升的T50缓冲冲洗未结合DNA的路程。注意:DNA分子将具体通过的NeutrAvidin - 生物素相互作用结合到表面上。
3. 填补了通道与包含氧清除系统^20（100毫米PCD，5毫米的PCA，1 mM的水溶性维生素E和500 mM氯化钠）的成像缓冲区。
4. 设置在帧传输模式的EMCCD流2×2的离散化的图像（256×256）到计算机每秒25帧。
5. 放置在显微镜物镜浸油，并用试样夹固定在显微镜载物台上的流动池。通过观察在墙壁上的激光反射图案粗调整焦点。用荧光IM的即时画面精细调焦年龄在监视器上。
6. 开始数据采集与532 nm激光。检查现场查看，并在必要时调整对焦。停止数据采集，当大多数分子的光漂白。
   注意:在这个设施，实验室编写C程序来控制显微镜和显示器上显示实时图像，因为它们被保存到硬盘上使用。

6，图像处理和数据分析

注:时间序列的256×256的图像是由一个MATLAB代码处理，生成的Cy3和Cy5强度单分子时间的痕迹。配对的供体通道和分割后的视点图像的受体通道之间的像素，6-7对Cy3和Cy5的斑点，每对来自同一分子穿过视场均匀地分散，是手工采摘，并且仿射变换使用这些点的坐标作为支撑点的计算方法。

1. 使用MATLAB脚本，通过所有的单分子时间看痕迹吨低和高的FRET信号之间的帽子秀多个过渡。确定循环和不成圈的状态。
   注:FRET信号被定义为Cy5 ​​的强度（I _一 ）除以的Cy3和Cy5的强度之和（I _A + I _D）。循环状态，具有较高的荧光共振能量转移的价值，同时不成圈状态，具有低FRET值。从一个单分子FRET信号的直方图是双峰分布，因为可逆循环和unlooping。
2. 发现，通过确定两个拟合高斯曲线之间的交叉点隔开的两个分布的阈值。
3. 计算FRET效率并指派具有高FRET值与不成圈的状态与低FRET值的循环状态。
4. 使用MATLAB脚本，分析分子（N（t））的累计数环（或由于在数据采集的开始时间不同的失误达到了高FRET状态）。注:由于双链DNA分子可以在数据采集开始在的不成圈状态的任何构象开始，增加了环形人口的比率，反映的平均循环率平均超过初始构象。提取循环率 k _循环用指数函数拟合N（T）: 如果增加biphasically，它可以被装配有双指数函数: 在这种情况下，K _循环从获得: 注意:从理论上讲，生存概率的聚合物并没有循环在时间t不是单一的或双指数函数^12。指数FITTing是用来作为一种实用的装置，提取该平均循环时间。

7，确定第j因子

注:歼因子代表如何集中一个双链DNA的一端周围的另一端。它可以通过内插的DNA中的一个端部段，将产生相同的反应速率与另一端部分作为测量循环速率的浓度来确定。在实验上，其一端部分被固定在表面上，而另一端段是在一定的浓度c引入。如果两端之间测量的退火速率为k _退火 ，然后歼因子²¹由下式给出 。退火速率常数（k _退火 = K _退火 / C）是独立于探头的浓度。

1. 流20μl的30-50 PM生物素Cy5的寡核苷酸（引物3）我成一的NeutrAvidin涂层通道。冲洗通道用100微升T50洗去未结合的寡核苷酸。
2. 准备成像缓冲器中的部分5与在50nM的终浓度添加Cy3标记的寡核苷酸（引物2）的说明。流入该成像缓冲器进入通道。
3. 在保持532 nm激光上，简要地打开640 nm激光，以确定表面结合Cy5标记的寡核苷酸的位置。关闭640 nm激光，并开始监测FRET信号。
   注意:当一个Cy3标记的寡到一个表面结合Cy5标记的寡核苷酸的杂交，Cy5的荧光将产生FRET。
4. 使用MATLAB脚本，分析分子开始在绑定状态（低Cy5的强度），但后来变成了退火状态（高Cy5的强度）作为时间从Cy5的强度痕迹函数的数量。
5. 剧情退火分子随时间的这个数字。适合这个曲线用单指数函数（ ）获得退火速率（K _退火 ）。
6. 重复此实验在不同的Cy3标记的寡核苷酸的浓度（60，100，和180纳米），以确认退火速率和反应物浓度之间的线性关系。解二阶退火速率常数（k _退火 ）从斜率。
7. 计算从歼因素 ，其中k是_循环在相同缓冲液条件下测得的循环速率。

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结果

用于循环研究DNA分子组成的可变序列和长度和单链突出端是彼此互补的双链区。的突出端，其中有7个碱基长，可彼此退火来捕获绕环状态。每个悬包含任何的Cy3和Cy5是通过亚酰胺化学联在DNA骨架。 Cy5的突出端还与生物素-TEG（15-原子四甘醇间隔），用于表面固定（参见图4A）相连。所有这些修改可以被掺入到双链以下以PCR为基础的协议（协议1和图3B）。所选择的长度出挑?...

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讨论

基于FRET一个简单的单分子实验来研究不同的内在形状DNA的循环动力学。弯曲的DNA可以通过重复一个10 - 聚体序列中的相位与10.5沸点螺旋周期来制备，并且其曲率可以用PAGE进行估计。这些dsDNAs都设计有粘性末端，让短暂的环路稳定性。我们从指数上升的环的分子数随时间提取的循环速率。断开连接的粘性末端段之间的退火速率常数是用来确定该浓度相当于该环形概率密度，这是被称为歼因子。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small DNA FRAG Extract Kit-100PR	VWR	97060-558
Acrylamide 40% solution 500 ml	VWR	97064-522
Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml	VWR	97063-948
GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp	Fermentas	SM0241
Mini Vertical PAGE System	VWR	89032-300
Syringe filter 0.2 μm CS50	VWR	A2666
Trolox	Sigma-Aldrich	238813-1G	triplet state quencher
Protocatechuic acid (PCA)	Sigma-Aldrich	08992-50MG	oxygen scavenging system
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	oxygen scavenging system
mPEG-silane, MW 2,000 1 g	Laysan Bio	MPEG-SIL-2000-1g
Biotin-PEG-Silane, MW 3,400	Laysan Bio	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein	Invitrogen	A2666
Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	F-540L
Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit	IBI Scientific	IB47020
Premium plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
VWR micro cover glass, rectangular, no. 1	VWR	48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater	Fisher Scientific		temperature control
Objective Cooling Collar	Bioptechs	150303	temperature control
KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage	Semprex	KMI53
High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW	Edmund optics	NT66-968	Cy3 excitation
CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector	Coherent	1139604	Cy5 excitation
650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter	Semrock	FF650-Di01-25x36	splitting dichroic
LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm	Semrock	LM01-552-25	combining dichroic
Brightline Fluorescence Filter 593/40	Semrock	FF01-593/40-25	Cy3 emission filter
635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm	Semrock	BLP01-635R-25	Cy5 emission filter
EMCCD iXon+	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
IX51 inverted microscope frame	Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF	Olympus
Immersion oil type-F for fluorescence microscopy	Olympus	IMMOIL-F30CC
2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated	Edmund optics	54-092	miniature mirror
1/4" Travel Single-Axis Translation Stage	Thorlabs	MS-1	translation of miniature mirror
Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm	Thorlabs	AC254-200-A	focusing lens
Adjustable Mechanical Slit	Thorlabs	VA100
Dielectric Mirror	Thorlabs	BB1-E02
Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm	Thorlabs	AC254-100-A	relay lens
Lens Mount for Ø1" Optics	Thorlabs	LMR1
Dichroic Filter Mount	Thorlabs	FFM1
Fixed Cage Cube Platform	Thorlabs	B3C
Kinematic Mount for Ø1" Optics	Thorlabs	KM100
N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm	Thorlabs	LA1422-A	collimating lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm	Thorlabs	LA1222-A	telescope lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm	Thorlabs	LA1433-A	telescope lens