血浆或尿液的水凝胶纳米粒子收获检测低丰度蛋白

摘要

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

摘要

新型生物标志物的发现在提供更多的敏感性和特异性疾病检测至关重要的作用。不幸的是许多存在于生物流体中低丰度生物标记物不能容易地与质谱法或免疫测定法，因为它们存在于非常低的浓度，是不稳定的，并且往往是由高丰度蛋白质，如白蛋白或免疫球蛋白掩蔽检测。诱饵含聚（N-异丙基丙烯酰胺）（NIPAM）基于纳米颗粒是能够克服这些生理屏障。在一个步骤中，他们能够捕捉，集中和保持体液的生物标记物。低分子量的分析物进入所述纳米颗粒的核心，由不同的有机的化学染料，它作为高亲和力蛋白诱饵被捕获。该纳米颗粒可以由几个数量级集中感兴趣的蛋白质。这个浓度因子是足以增加蛋白质水平，使得蛋白质内的目前质谱仪，免疫印迹和免疫检测限。纳米颗粒可以一起孵育过多的生物体液和它们能够极大丰富的低分子量蛋白质和肽的浓度，同时排除白蛋白和其它高分子量的蛋白质。我们的数据表明，在特定分析物的浓度的10,000倍放大，可以实现，使质谱和免疫检测以前无法检测的生物标志物。

引言

尽管完成了人类基因组测序，显著进展尚未作出确定的生物标志物预测的早期阶段的疾病，或与治疗结果，或预测¹相关。其中一个原因缺乏进展是，很多潜在的生物标志物显著以低于传统质谱和其他生物标志物发现平台的检测极限浓度存在。质谱（MS）和多反应监测（MRM）具有典型的检测灵敏度大于50纳克/毫升，而在50 pg / ml和10毫微克/毫升在临床实验室下降了免疫测定的范围广大的分析物的。这意味着许多生物标志物，特别是在疾病的早期阶段无法通过常规的MS和MRM ²被检测到。除了高丰度蛋白质，如白蛋白和免疫球蛋白的复合物的生物流体的存在往往掩盖由十亿倍货存ESS的低丰度，低分子量蛋白质和肽^3，4。为此几个样品的准备步骤之前所需要质谱测序和鉴定。一个这样的预备步骤中采用的高丰度蛋白质的与市售的耗尽列^5-8的耗尽。不幸的是这一步骤导致候选生物标志物的产率的降低，因为它们通常是非共价地与该被除去的载体蛋白相关联。另一个挑战是候选生物标志物前体的稳定性表示，一旦样品的采集。蛋白质是发生降解内源性或外源性蛋白酶^9。水凝胶的纳米颗粒可以通过扩增推定的生物标志物的浓度，以测定的范围内的电平超越这些关键的挑战，同时保护蛋白免受降解^10-13。

要注意个很重要在LMW在血液中的蛋白质是小完整蛋白质以及大蛋白的片段的混合物。组织来源的蛋白质比60 kDa的较大的过大而不能穿过血管基底膜被动地进入血流，但它们可以在血液中作为肽或蛋白质片段¹⁴来表示。我们的目标是测量新颖循环生物标志物，可以是候选疾病的早期发现，患者分层为治疗，并监测对治疗的反应。在创建了纳米颗粒选择性地排除高丰度的免疫球蛋白和白蛋白，同时捕获较小的蛋白质和肽，并根据初始体积上集中起来，以100倍。

我们的团队确定了一套小的有机染料，可成功地用作高亲和力的分子饵料蛋白质和多肽。蛋白质 - 染料的结合被认为是由于疏水性和静电相互作用的结合第对染料的芳环交织经由蛋白质上的表面¹¹的疏水口袋的蛋白质。

的毒饵，这取决于它们的化学性质，表现出分析物的选择的类的特定亲和力。诱饵与载体蛋白竞争，如白蛋白，用于蛋白质或肽。低分子量蛋白/肽被截留在颗粒中。高分子量的蛋白质，如白蛋白和球蛋白是从进入的，因为筛分能力的粒子可防止因水凝胶^11（图1）的限制孔。

水凝胶粒子是通过由过硫酸铵¹¹开始沉淀聚合合成。异丙基丙烯酰胺（NIPAM），丙烯酸（AAC）和烯丙基胺（AA）和交联剂N，N'-亚甲基双（BIS）的共聚单体被允许在70℃下反应6小时，在稀释条件¹1,13。聚的高蛋白结合亲和性（N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸）（聚（NIPAM-CO-AAC）nanoparticlesis通过共价掺入含氨基的染料（ 即 ，sulfonatedanthraquinonetriazine染料）在纳米粒子，通过实现在这取决于染料的亲水/疏水特性的水性或有机溶剂中进行的酰胺化反应^{如图11所示，}用一个anthraquinonetriazine染料的氯原子在纳米颗粒中的胺基团的^13。亲核取代被用于创建聚含染料（NIPAM -共聚-丙烯胺）（AA）的纳米颗粒^11，12。的两步聚合方法被用来创建含有乙烯基磺酸^{（VSA）11，13}的外壳的水凝胶粒子。

水凝胶纳米粒子可用于各种生物流体，包括全血，血浆，血清，脑脊液，汗液，尿等。在一个步骤中，在溶液中，nanoparticles进行快速（几分钟内）封存和低分子量的分析物浓度^{10，11，13，15-18。}蛋白质随后从纳米颗粒洗脱和检测用蛋白质印迹^19-21，质谱法^{10，11，13，15，18，22，23，}免疫/ ELISA ^{10，11，15，18，}或反相蛋白质微阵列^{16， 24}测定。纳米功能化化学饵料，并提出核或核 - 壳结构，捕捉和集中的基础上饵/壳的物理化学性质的蛋白质。因此，掺入纳米颗粒不同的染料将捕获的蛋白质的不同亚群具有不同的基础上，染料亲和效率，溶液的pH，并且存在/不存在竞争的高丰度蛋白^13。此外，纳米颗粒的相对量，以将溶液的体积将影响从纳米颗粒中的蛋白质的产率。这些方面水凝胶的纳米粒子的收获是使用三种不同的纳米颗粒饵收割蛋白是由含有高含量的蛋白质的血浆样品显示出，并从尿样品通常不包含大量的蛋白质。在这个协议中，我们证明收获和浓缩使用聚（NIPAM-CO-的AAc），聚（NIPAM /染料），以及核 - 壳纳米颗粒的血浆样品的肿瘤坏死因子α（TNFα）（聚（NIPAM-CO-VSA）） 。聚（NIPAM /染料）的纳米颗粒被示为集中于加入人尿样品分枝杆菌抗原，以模仿结核分枝杆菌感染的个体。

研究方案

人血浆和尿液是从健康志愿捐献者采集，并以书面的知情同意书，下面的乔治·梅森大学机构审查委员会批准的协议。捐助者平均分配白人男性和女性之间的25和42样品进行单独分析岁之间，并没有合并。

血清或血浆样品1纳米工艺

在等离子体电势低丰度生物标记物被捕获，在溶液中，用凝胶粒子。将粒子加入到等离子体中，温育，通过离心分离，洗涤，和所捕获的蛋白被洗脱。将洗脱的蛋白质根据用于下游质谱测序和鉴定的氮气流中干燥。

1. 在离心管2与50毫米TrisHCl pH值为7（500微升血+500微升TrisHCl）的稀释:500微升血清1。
2. 加入500μl聚（异丙基丙烯酰胺/ AAC）核心nanop的文章。孵育15分钟，在室温。
3. 在装有固定角转子的离心旋转的样品在16,100 XG，25℃下进行10分钟。拆下并丢弃上清液。
4. 加入500μl加入硫氰酸钠（25毫摩尔）的粒料。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。
5. 在具有固定角度转子离心机旋转样品在16,100 XG，25℃下进行10分钟。拆下并丢弃上清液。
6. 加入500微升的MilliQ水的纳米颗粒沉淀。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。
7. 在具有固定角度转子离心机旋转样品在16,100 XG，25℃下进行10分钟。拆下并丢弃上清液。
8. 准备新鲜的洗脱缓冲液:加入700μL乙腈300μL氢氧化铵在一个干净的试管中。注意:氢氧化铵具有腐蚀性。使用适当的通风。注意:洗脱缓冲液必须准备ARED即将使用前。请勿将洗脱缓冲液。
9. 加入300微升的洗脱缓冲液中的纳米颗粒。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。孵育15分钟，在室温。
10. 在具有固定角度转子离心机旋转样品在16,100 XG，25℃下进行10分钟。取出并保存洗脱液在干净，标记的离心管。
11. 重复步骤1.9 - 1.10。二者结合起来洗脱液为一体的离心管。
12. 干燥下，在氮气蒸发器歧管的氮气流的洗脱液在42.1℃，用空气流设置为8（ 图2F）。
13. 储存在室温下干燥洗脱液为O / N个存储，或在-20℃下长期贮存，前质谱法，免疫印迹，或酶联免疫吸附试验（可选）。

尿液样本2纳米工艺

正常尿液中含有低于30毫克/分升的蛋白质和比1 +血少。然而，很多疾病/状况可能改变尿蛋白和血液的正常水平。为了帮助确定纳米颗粒的最佳量添加到尿样，尿分析之前进行纳米粒子的收获进行。尿液生物标志物可以存在于非常低的浓度，这可能需要优化的纳米颗粒的比对尿量。此过程说明了下游Western blot分析尿液样本的纳米粒子收获。

1. 收集尿液样本中的清洁，干燥的塑料杯。 à22毫升最小的体积是必需的。商店尿液标本在-80°C，直到准备分析。
2. 解冻的冷冻尿液在室温或4°CO / N。在旋涡混合器简要组合。倾至少22毫升尿入50毫升的锥形底聚丙烯管中。
3. 旋尿中有水平转子离心机在3700 XG 15分钟。倒出尿液，而不会干扰颗粒，放入干净的50ml锥形底polypropylene管。弃沉淀。
4. 使用多分析物"尿液试纸"的试剂条进行尿检。注意事项:避免阳光直射，湿度^17，18的试纸存放在密闭的容器了。
   1. 莱试剂条，面朝上，放在干净，干燥的纸巾。
   2. 使用一次性吸管吸1毫升步骤2.3准备的尿液。
   3. 2分钟设置一个计时器，但不启动它。快速分配1 - 在试剂条的每个测试点2滴尿。立即启动定时器。注意:不要直接在尿液的容器浸入试剂条。在试剂条上的染​​料/化学指标可以潜在浸出试剂条的进入尿液的容器中。
   4. 在使用的试剂条容器所指示的时间，由单独的试剂条的颜色进行比较，对相应的颜色编码的籼稻记录定性结果的试剂条上的各种分析物器试剂容器上。典型的正常尿的结果是:（正常的或负的）的血液，蛋白质，白细胞，亚硝酸盐，葡萄糖，酮，胆红素和尿胆素原;尿pH值（5.5 - 7.0）;比重（1.001 - 1.020）。注意:高蛋白质水平在尿液样本可以与感兴趣的蛋白质竞争结合于所述纳米颗粒的站点。为了最大限度地提高蛋白质的收获与纳米颗粒，该纳米颗粒体积/尿体积比率可以调整为从高丰度蛋白质或者限制竞争，或者可以被优化到收获中存在的浓度非常低的蛋白质。如果尿蛋白值是1 +或更高，在下面的步骤中添加2.5纳米的2倍量。如果感兴趣的分析物是非常低丰度蛋白质，它可能是必要的，以增加纳米颗粒的量最多至2ml（图3）。
5. 将20毫升的尿液澄清步骤2.3到一个干净的50ml锥形底聚丙烯管。别扰乱任何碎片/丸粒可能在尿液管的底部。加入200μl纳米颗粒的20毫升尿样。在旋涡混合器简要组合。注意:如果尿蛋白值是1 +或更高，加入400μl的纳米颗粒到20ml的尿液。
6. 30分钟，在室温下孵育尿/纳米颗粒的混合物，无摆动/混合。
7. 旋尿/纳米颗粒悬浮液在配备水平转子在3700离心10 min的离心机。注意:如果粒料是不可见的离心后，旋转试样进行一个额外的2 - 7分钟。
8. 拆下并丢弃上清液。加入500μl的MilliQ水的纳米颗粒沉淀。
9. 通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。纳米粒子溶液转移到一个干净的1.5 ml离心管。
10. 纺纳米颗粒在装备有固定角度转子以16,100 xg离心10分钟，离心。注意:如果小球是不可见的甲级降脂离心，旋转试样进行一个额外的2 - 7分钟。
11. 拆下并丢弃上清液。
12. 重复步骤2.8和2.11（两次），用200μl18的MilliQ水冲洗该纳米颗粒。
13. 准备新鲜的洗脱缓冲液:加入970μL乙腈至30微升氢氧化铵在一个干净的试管中。注意:氢氧化铵具有腐蚀性。使用适当的通风。注意:洗脱缓冲液必须临用前制备。请勿将洗脱缓冲液。
14. 加入20微升的洗脱缓冲液的纳米颗粒沉淀。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。孵育15分钟，在室温。
15. 纺纳米颗粒样品在16100×g离心10分钟。取出并保存在上清干净，1.5 ml离心管。不破坏纳米颗粒。丢弃在生物危害的垃圾沉淀。
16. 将样品在通风橱机架。打开瓶盖和公司ubate在室温30分钟。或者，将下在40℃的氮气流中的样品直至干燥（1 - 2小时）。
17. 加入15微升的Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液（2×）的样品。热火100 ℃，在5分钟的盖子，直至留在管内的体积的干热块是不超过20微升。注意:不要用沸水浴中。从水浴中的湿度会防止缓冲器的蒸发。
18. 广场上的管帽。从加热块中取出试管。可将样品保存在-80℃下或立即用于下游免疫印迹分析。

结果

水凝胶纳米粒子大小和均匀度

聚（NIPAM-AAC）颗粒已产生极高的收益率和可重复性的和批次内。所述颗粒具有在RT非常好的胶体稳定性期间需要用于捕获，存储，和蛋白质的洗脱（至少48小时）的时间，以及纳米颗粒沉淀没有被观察到（ 图^1）11。胶体稳定性可能是由该纳米颗粒快速蛋白质/肽的摄取很重要。

从血浆?...

讨论

临床意义

血清或血浆样品被认为含有低丰度循环的蛋白质和多肽可提供的信息有关的生物体作为一个整体的国家的丰富来源。尽管血清蛋白质组学的承诺，有三个基本的和严重的生理障碍，阻碍生物标志物的发现和翻译临床获益^{10，11，16，25。}

一，重要诊断标志物可能存在于非常低丰度（浓度）在血液中。早期病变组织，例如预转?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
hydrogel nanoparticles	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water			Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50mM pH7.0	VWR	IC816116	50mM, pH 7
Acetonitrile	BDH	BDH1103-4LP	available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH	BDH	BDH3014	available from VWR, assayed at 28-30% NH3
sodium thiocyanate 25mM	Acros Organics	419675000	for serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips	Siemens	2161	for urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	use at room temperature to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block	Barnstead	11-715-125DQ	do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold	Organomation Associates	Microvap118	for serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor	Sorvall	Legend series	50ml tube capacity, rcf 3700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor	Eppendorf	5424	1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22	with screw caps for urine samples
1.5ml microcentrifuge tubes	Eppendorf	22363204
Disposable plastic transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	at least 1ml capacity
Vortex mixer	Fisher Scientific	50-949-755
Timer	Fisher Scientific	S04782	seconds/minutes