Hidrogel Nanoparticle recolección de plasma o de orina para la detección de proteínas de baja abundancia

Resumen

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Resumen

El descubrimiento de biomarcadores Novela juega un papel crucial en la prestación de detección de la enfermedad más sensible y específica. Desafortunadamente muchos biomarcadores de baja abundancia que hay en fluidos biológicos no pueden ser fácilmente detectados con espectrometría de masas o inmunoensayos, ya que están presentes en muy baja concentración, son lábiles, y son a menudo enmascarados por proteínas de alta abundancia tales como albúmina o inmunoglobulina. Bait contiene poli (N-isopropilacrilamida) (Nipam) nanopartículas a base son capaces de superar estas barreras fisiológicas. En un paso que son capaces de captar, concentrar y preservar biomarcadores de fluidos corporales. -Analitos de bajo peso molecular entran en el núcleo de la nanopartícula y son capturados por diferentes tintes químicos orgánicos, que actúan como cebos de proteína de alta afinidad. Las nanopartículas son capaces de concentrar las proteínas de interés en varios órdenes de magnitud. Este factor de concentración es suficiente para aumentar el nivel de proteína de tal manera que las proteínas están dentro de lalímite de detección de los espectrómetros de masas actuales, el Western Blot, e inmunoensayos. Las nanopartículas se pueden incubar con una plétora de fluidos biológicos y que son capaces de enriquecer en gran medida la concentración de proteínas y péptidos de bajo peso molecular mientras que excluye la albúmina y otras proteínas de alto peso molecular. Nuestros datos muestran que una amplificación de 10.000 veces en la concentración de un analito particular se puede lograr, lo que permite espectrometría de masas y los inmunoensayos para detectar biomarcadores previamente indetectables.

Introducción

A pesar de la finalización de la secuenciación del genoma humano, no se ha logrado avances significativos en la identificación de biomarcadores predictivos de la enfermedad en etapa temprana, o que se correlacionan con el resultado terapéutico o pronóstico ^1. Una razón para esta falta de progreso es que existen muchas biomarcadores potencialmente significativos a una concentración por debajo del límite de detección de espectrometría de masas convencional y otras plataformas de descubrimiento de biomarcadores. Espectrometría de masas (MS) y Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM) tienen una sensibilidad de detección típicamente mayor que 50 ng / ml, mientras que la mayoría de los analitos medidos por inmunoensayos en una caída de laboratorio clínico en el intervalo entre 50 pg / ml y 10 ng / ml . Esto significa que muchos biomarcadores, en particular en la etapa temprana de una enfermedad no pueden ser detectados por MS convencional y MRM ^2. Además, la presencia de proteínas de alta abundancia tales como la albúmina y la inmunoglobulina en fluidos biológicos complejos, con frecuencia máscara por exc mil millones de vecesess de baja abundancia, proteínas de bajo peso molecular y péptidos ^{3, 4.} Por esta razón se requieren varias etapas preparatorias de la muestra antes de la secuenciación de espectrometría de masas y la identificación. Uno de tales paso preparatorio emplea el agotamiento de proteínas de alta abundancia con columnas de agotamiento disponibles comercialmente ^5-8. Desafortunadamente este paso conduce a la reducción del rendimiento de biomarcadores candidatos porque son a menudo asociadas no covalentemente con proteínas portadoras que están siendo eliminados. Otro desafío está representado por la estabilidad de biomarcadores candidatos ex vivo una vez que se recogieron las muestras. Las proteínas están sujetos a la degradación por proteasas endógenas o exógenas ^9. Nanopartículas hidrogel puede superar estos retos críticos mediante la amplificación de la concentración de biomarcador putativo a un nivel dentro del rango del ensayo, mientras que la protección de la proteína de la degradación ^10-13.

Es importante señalar ªLMW en proteínas en la sangre son una mezcla de proteínas intactas pequeñas, así como fragmentos de proteínas grandes. Proteínas del tejido derivado de más de 60 kDa son demasiado grandes para entrar pasivamente el flujo de sangre a través de la membrana basal vascular, pero pueden ser representados en la sangre como péptidos o fragmentos de proteínas ^14. Nuestro objetivo es medir los biomarcadores novedosos de circulación que pueden ser candidatos para la detección temprana de la enfermedad, estratificación de los pacientes para la terapia y el seguimiento de la respuesta al tratamiento. Nuestros nanopartículas se crean para excluir selectivamente inmunoglobulinas alta abundancia y albúmina, mientras que la captura simultáneamente proteínas y péptidos más pequeños y concentrándolos hasta 100 veces, dependiendo del volumen de partida.

Nuestro grupo identificó un conjunto de pequeñas colorantes orgánicos que pueden actuar con éxito como de alta afinidad cebos moleculares para proteínas y péptidos. Colorante de unión a proteínas se cree que es debido a una combinación de interacción hidrófoba y electrostáticas. Los anillos aromáticos en el tinte se intercalan con las proteínas a través de bolsillos hidrófobos sobre la superficie de la proteína ^11.

Los cebos, dependiendo de su química, muestran una afinidad particular para las clases de analitos seleccionados. Los cebos compiten con las proteínas portadoras, como la albúmina, para las proteínas o péptidos. El peso de proteínas / péptidos de bajo peso molecular se quedan atrapados en la partícula. Proteínas de alto peso molecular tales como la albúmina y la inmunoglobulina se impide la entrada de la partícula debido a la capacidad de tamizado debido a la restrictiva de poro del hidrogel ¹¹ (Figura 1).

Nanopartículas de hidrogel son sintetizados por polimerización por precipitación iniciada por persulfato de amonio ^11. N-isopropilacrilamida (Nipam), co-monómeros de ácido acrílico (AAC) y alilamina (AA) y el agente de reticulación N, N '-Methylenebisacrylamide (BIS) se dejó reaccionar a 70 ° C durante 6 horas en condiciones diluidas ¹1, 13. La afinidad de unión de alta proteína de poli (N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico) (poli (NIPAM-co-AAC) nanoparticlesis logrado mediante la incorporación de covalentemente colorantes que contienen grupos amino (es decir., Colorantes sulfonatedanthraquinonetriazine) en las nanopartículas a través una reacción de amidación se realiza en disolventes acuosos u orgánicos dependiendo de las características hidrófilas / hidrófobas de los colorantes ^11, se utiliza ^13. sustitución nucleofílica de los grupos amina en la nanopartícula con el átomo de cloruro de un colorante anthraquinonetriazine para crear poli contiene el colorante (Nipam -CO-alilamina) (AA) nanopartículas ^{11, 12.} Un procedimiento de polimerización de dos etapas se utiliza para crear nanopartículas de hidrogel que contiene una capa exterior de ácido vinilsulfónico (VSA) ^{11, 13.}

Nanopartículas de hidrogel se pueden aplicar a diversos fluidos biológicos, incluyendo sangre entera, plasma, suero, fluido cerebroespinal, sudor, y orina. En un solo paso, en solución, la nanoparticles realizan una rápida (en minutos) el secuestro y la concentración de analitos de bajo peso molecular ^{10, 11, 13, 15-18.} Las proteínas se eluyeron posteriormente de las nanopartículas y se detectaron usando Western Blot ^19-21, espectrometría de masas ^{10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23,} inmunoensayos / ELISA ^{10, 11, 15, 18,} ​​o microarrays de proteínas de fase inversa ^{16, 24} ensayos. Las nanopartículas funcionalizadas con el cebo químico, y la presentación de un núcleo o núcleo de la arquitectura cáscara, captura y se concentran las proteínas sobre la base de las propiedades fisicoquímicas de cebo / corteza. Diferentes colorantes incorporados en las nanopartículas, por lo tanto capturar diferentes subconjuntos de proteínas con eficiencia basado en la afinidad de tinte, el pH de la solución, y la presencia / ausencia de competir proteínas de alto abundante ¹³ variable. Además, la cantidad de nanopartículas en relación con el volumen de la solución afectará a la producción de proteína a partir de las nanopartículas. Estos aspectos dehidrogel nanopartícula cosecha se demostró utilizando tres cebos nanopartículas diferentes para las proteínas de recolección de muestras de plasma que contienen altas cantidades de proteínas, y de las muestras de orina que normalmente no contienen grandes cantidades de proteína. En este protocolo se demuestra la recolección y la concentración de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) a partir de muestras de plasma utilizando poli (NIPAM-co-AAC), poli (NIPAM / tinte), y las nanopartículas core-shell (poli (NIPAM-co-VSA)) . Poli (NIPAM / colorante) nanopartículas se muestran para concentrar el antígeno especies Mycobacterium que se añadió a las muestras de orina humanos, para imitar los individuos infectados por el Mycobacterium tuberculosis.

Protocolo

El plasma humano y se recogió la orina de donantes voluntarios sanos, con el consentimiento informado por escrito, después de George Mason University Institutional Review Board aprobó protocolos. Los donantes se distribuyeron por igual entre hombres caucásicos y mujeres entre las edades de 25 y 42 muestras fueron analizadas de forma individual y no se agruparon.

1. Nanoparticle Procesamiento de suero o plasma Muestras

Biomarcadores abundantes bajas potenciales en plasma son capturados, en solución, con nanopartículas de hidrogel. Las partículas se añaden al plasma, se incubaron, separadas por centrifugación, se lavaron, y las proteínas capturadas se eluyen. Las proteínas eluidas se secan bajo flujo de nitrógeno durante aguas abajo secuenciación de espectrometría de masas y la identificación.

1. Diluir 500 l de suero de 1: 2 con 50 mM Tris HCl pH 7 (500 l de suero + 500 l Tris HCl) en un tubo de microcentrífuga.
2. Añadir 500 l de poli (Nipam / AAC) nanop núcleoartículos. Incubar durante 15 min a TA.
3. Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo. Retire y deseche el sobrenadante.
4. Añadir 500 l tiocianato de sodio (25 mM) al sedimento. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces.
5. Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo. Retire y deseche el sobrenadante.
6. Añadir 500 l de agua MilliQ al sedimento de nanopartículas. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces.
7. Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo. Retire y deseche el sobrenadante.
8. Prepare el buffer de elución fresca: Añadir 700 l de acetonitrilo a 300 l de hidróxido de amonio en un tubo limpio. Precaución: El hidróxido de amonio es corrosivo. Utilizar con una ventilación adecuada. Nota: El tampón de elución debe ser prepared inmediatamente antes del uso. No guarde el tampón de elución.
9. Añadir 300 l de tampón de elución al sedimento de nanopartículas. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. Incubar durante 15 min a TA.
10. Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo. Retire y guarde el eluido en un tubo de microcentrífuga limpio, etiquetado.
11. Repita los pasos 1.9 a 1.10. Combinar los dos eluidos en un tubo de microcentrífuga.
12. Secar los eluidos bajo flujo de nitrógeno en un colector del evaporador de nitrógeno a 42,1 ° C, con flujo de aire se establece en 8 (Figura 2F).
13. Almacenar el producto eluido se secó a temperatura ambiente durante O / N de almacenamiento, o a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo, antes de la espectrometría de masas, el Western Blot, o ensayos ELISA (opcional).

2. Procesamiento de nanopartículas de Muestras de orina

La orina normal contiene menos de 30 mg / dl de proteína ymenos de 1+ sangre. Sin embargo, muchas enfermedades / condiciones pueden alterar los niveles normales de proteína en la orina y la sangre. Para ayudar en la determinación del volumen óptimo de nanopartículas para añadir a la muestra de orina, un análisis de orina se lleva a cabo antes de la recolección de nanopartículas. Pueden existir biomarcadores de orina en concentraciones extremadamente bajas, que pueden requerir la optimización de la relación de las nanopartículas con el volumen de orina. Este procedimiento describe nanopartículas recolección de muestras de orina para el análisis de transferencia de Western aguas abajo.

1. Recoger muestras de orina en un vaso de plástico limpio y seco. Se requiere un volumen mínimo de 22 ml. Orina conserve las muestras a -80 ° C hasta el momento de analizar.
2. Descongele la orina congelada a temperatura ambiente oa 4 ° CO / N. Mezclar brevemente en un vórtex. Vierta al menos 22 ml de orina en un tubo de polipropileno de fondo cónico de 50 ml.
3. Gira la orina en una centrífuga con un rotor oscilante en 3700 xg durante 15 min. Decantar la orina, sin perturbar el sedimento, en un polypr fondo cónico de 50 ml limpiotubo opylene. Deseche el sedimento.
4. Realice un análisis de orina usando un multi-analito "tira reactiva de orina" tira reactiva. Nota: almacene las tiras reactivas en un recipiente herméticamente cerrado, protegido de la luz solar directa y la humedad ^{17, 18.}
   1. Coloque la tira reactiva, boca arriba, sobre una toalla de papel limpia y seca.
   2. Usar una pipeta desechable para aspirar 1 ml de la orina preparado en la etapa 2.3.
   3. Establecer un temporizador durante 2 minutos, pero no lo inicie. Dispensar rápidamente 1 - 2 gotas de orina en cada almohadilla de prueba de la tira de reactivo. Iniciar inmediatamente el temporizador. Nota: No sumerja la tira reactiva directamente en el recipiente de la orina. Los indicadores de colorante / químicas en la tira de reactivo potencialmente pueden filtrarse fuera de la tira de reactivo en el recipiente de orina.
   4. A la hora indicada en el envase tira de reactivo, registrar los resultados cualitativos para los diversos analitos en la tira de reactivo mediante la comparación del color de las tiras reactivas individuales en los correspondientes indica un código de coloresres en el recipiente de reactivo. Resultados de orina normales típicos son: (normal o negativo) de sangre, proteínas, leucocitos, nitrito, glucosa, cetona, bilirrubina y urobilinógeno; PH de la orina (5,5 a 7,0); gravedad específica (1,001-1,020). Nota: Los niveles altos de proteína en una muestra de orina, pueden competir con la proteína de interés en los puntos de las nanopartículas vinculante. Para maximizar la cosecha proteína con nanopartículas, la relación de volumen de volumen de nanopartículas / orina se puede ajustar a cualquiera de limitar la competencia de las proteínas de alta abundancia, o puede ser optimizado para cosechar las proteínas que existen en concentraciones muy bajas. Si el valor de proteína en la orina es 1 + o mayor, añadir volúmenes 2x de las nanopartículas en el paso 2.5 a continuación. Si el analito de interés es una proteína abundante muy bajo, puede ser necesario aumentar el volumen de las nanopartículas hasta 2 ml (Figura 3).
5. Transferir 20 ml de la orina aclarado desde el paso 2.3 en un tubo de polipropileno de 50 ml de fondo cónico limpio. Noperturbar cualquier residuo / pellet que puede estar en la parte inferior del tubo de la orina. Añadir 200 l de nanopartículas a la muestra 20 ml de orina. Mezclar brevemente en un vórtex. Nota: Si el valor de proteína en la orina es 1 + o mayor, añadir 400 l de nanopartículas a 20 ml de orina.
6. Incubar la mezcla de orina / nanopartícula durante 30 min a RT, sin balanceo / mezcla.
7. Haga girar la suspensión orina / nanopartícula en una centrífuga equipada con un rotor oscilante en 3700 xg durante 10 min. Nota: Si un pellet no es visible después de la centrifugación, girar las muestras para un adicional de 2 - 7 min.
8. Retire y deseche el sobrenadante. Añadir 500 l de agua MilliQ al sedimento de nanopartículas.
9. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. Transferir la solución de nanopartículas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio.
10. Girar las nanopartículas en una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo a 16.100 xg durante 10 min. Nota: Si un pellet no es visible folLowing centrifugación, girar las muestras para un adicional de 2 - 7 min.
11. Retire y deseche el sobrenadante.
12. Repita los pasos 2,8 y 2,11 (dos veces) con 200 l 18 MilliQ agua para lavar las nanopartículas.
13. Prepare el buffer de elución fresca: Añadir 970 l de acetonitrilo a 30 l de hidróxido de amonio en un tubo limpio. Precaución: El hidróxido de amonio es corrosivo. Utilizar con una ventilación adecuada. Nota: El tampón de elución debe prepararse inmediatamente antes de su uso. No guarde el tampón de elución.
14. Añadir 20 l de tampón de elución al sedimento de nanopartículas. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. Incubar durante 15 min a TA.
15. Haga girar las muestras de nanopartículas a 16.100 xg durante 10 min. Retire y guarde el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. No perturbar el sedimento de nanopartículas. Deseche el sedimento en la basura de riesgo biológico.
16. Colocar las muestras en un estante en una campana para vapores químicos. Abra las tapas y aumUbaté a TA durante 30 min. Alternativamente, colocar las muestras bajo flujo de nitrógeno a 40 ° C hasta que se seque (1 - 2 h).
17. Añadir 15 l de Tris-glicina SDS tampón de muestra (2x) a las muestras. Se calienta a 100 ° C en un bloque de calor seco durante 5 minutos con las tapas abiertas o hasta que el volumen que queda en el tubo no es más de 20 l. Nota: no utilizar un baño de agua hirviendo. La humedad del baño de agua será evitar la evaporación de la memoria intermedia.
18. Coloque la tapa en los tubos. Sacar los tubos del bloque de calor. La muestra puede ser almacenada a -80 ° C o utilizarse inmediatamente para el análisis de transferencia de western aguas abajo.

Resultados

Hidrogel Nanoparticle Tamaño y Uniformidad

Poli (Nipam-AAC) partículas se han producido con muy alto rendimiento y reproducibilidad entre y dentro de los lotes. Las partículas tienen muy buena estabilidad coloidal a temperatura ambiente durante el tiempo necesario para la captura, almacenamiento, y la elución de las proteínas (por lo menos 48 h), y la precipitación de nanopartículas no se ha observado (Figura 1) ^11. La estabilidad coloidal ...

Discusión

Importancia clínica

Se cree que una muestra de suero o plasma para contener baja abundancia de proteínas y péptidos que pueden proporcionar una rica fuente de información sobre el estado del organismo en su conjunto en circulación. A pesar de la promesa de la proteómica en suero, hay tres barreras fisiológicas fundamentales y serios que frenan el descubrimiento de biomarcadores y la traducción al beneficio clínico ^{10, 11, 16, 25.}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
hydrogel nanoparticles	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water			Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50mM pH7.0	VWR	IC816116	50mM, pH 7
Acetonitrile	BDH	BDH1103-4LP	available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH	BDH	BDH3014	available from VWR, assayed at 28-30% NH3
sodium thiocyanate 25mM	Acros Organics	419675000	for serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips	Siemens	2161	for urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	use at room temperature to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block	Barnstead	11-715-125DQ	do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold	Organomation Associates	Microvap118	for serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor	Sorvall	Legend series	50ml tube capacity, rcf 3700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor	Eppendorf	5424	1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22	with screw caps for urine samples
1.5ml microcentrifuge tubes	Eppendorf	22363204
Disposable plastic transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	at least 1ml capacity
Vortex mixer	Fisher Scientific	50-949-755
Timer	Fisher Scientific	S04782	seconds/minutes