Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine ​​a basso Abbondanza

Riepilogo

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Abstract

Scoperta di biomarcatori romanzo gioca un ruolo cruciale nel fornire il rilevamento delle malattie più sensibile e specifica. Purtroppo molti biomarcatori bassa abbondanza che esistono nei fluidi biologici non possono essere facilmente individuati con la spettrometria di massa o immunologici perché sono presenti in concentrazioni molto basse, sono labili, e sono spesso mascherati da proteine ​​ad alta abbondanza, come l'albumina e immunoglobulina. Bait contenente poli (N-isopropilacrilammide) (NIPAM) nanoparticelle a base sono in grado di superare queste barriere fisiologiche. In un passo sono in grado di catturare, concentrare e preservare biomarcatori da fluidi corporei. Analiti basso peso molecolare entrano nel nucleo della nanoparticella e vengono catturati da diversi coloranti chimici organici, che fungono da alta affinità esche proteiche. Le nanoparticelle sono in grado di concentrare le proteine ​​di interesse di parecchi ordini di grandezza. Questo fattore di concentrazione è sufficiente aumentare il livello di proteina tale che le proteine ​​sono all'internolimite di rilevazione di spettrometri di massa attuali, western blotting e saggi immunologici. Le nanoparticelle possono essere incubate con una pletora di fluidi biologici e sono in grado di arricchire notevolmente la concentrazione di proteine ​​a basso peso molecolare e peptidi, escludendo albumina e altre proteine ​​ad alto peso molecolare. I nostri dati mostrano che una piega amplificazione 10.000 nella concentrazione di un particolare analita può essere raggiunto, consentendo spettrometria di massa e test immunologici per rilevare biomarker precedentemente non rilevabili.

Introduzione

Nonostante il completamento del sequenziamento del genoma umano, non sono stati compiuti progressi significativi in biomarcatori predittivi di identificazione di malattia in stadio precoce, o che la correlazione con il risultato terapeutico, o la prognosi ^1. Uno dei motivi di questa mancanza di progresso è che esistono molti biomarcatori potenzialmente significative ad una concentrazione al di sotto del limite di rilevazione di spettrometria di massa convenzionale e altre piattaforme di scoperta biomarker. La spettrometria di massa (MS) e multipla Reaction Monitoring (MRM) hanno una sensibilità di rilevamento tipicamente superiore a 50 ng / ml, mentre la maggior parte degli analiti misurati da test immunologici caduta laboratorio clinico nell'intervallo tra 50 pg / ml e 10 ng / ml . Questo significa che molti biomarcatori, in particolare nella fase iniziale di una malattia non possono essere rilevati da MS convenzionale e MRM ^2. Inoltre la presenza di proteine ​​ad alta abbondanza come albumina e immunoglobuline nei fluidi biologici complessi maschera spesso da miliardi di volte excess bassa abbondanza, proteine ​​a basso peso molecolare e peptidi ^{3, 4.} Per questo motivo sono necessari prima di sequenziamento spettrometria di massa e di identificazione diversi passaggi di preparazione del campione. Un tale passo preparatorio impiega l'esaurimento di proteine ​​di alta abbondanza con colonne di esaurimento disponibili in commercio ^5-8. Purtroppo questo passaggio porta alla riduzione del rendimento di biomarker candidati perché sono spesso non covalentemente legato al proteine ​​carrier che vengono rimossi. Un'altra sfida è rappresentata dalla stabilità dei biomarcatori candidati ex-vivo una volta che i campioni vengono raccolti. Le proteine ​​sono soggetti a degradazione da proteasi endogene o esogene ^9. Nanoparticelle idrogel possono superare queste sfide critiche amplificando la concentrazione biomarcatore putativo a un livello entro l'intervallo del dosaggio, proteggendo la proteina dal degrado ^10-13.

E 'importante notare tha LMW proteine ​​nel sangue sono una miscela di piccole proteine ​​intatte così come frammenti di proteine ​​di grandi dimensioni. Proteine ​​derivate dal tessuto superiore a 60 kDa sono troppo grandi per entrare passivamente il flusso sanguigno attraverso la membrana basale vascolare, ma possono essere rappresentati nel sangue come peptidi o frammenti di proteine ^​​14. Il nostro obiettivo è quello di misurare nuovi biomarcatori circolanti che possono essere candidati per la diagnosi precoce della malattia, stratificazione dei pazienti per la terapia e monitorare la risposta alla terapia. Le nostre nanoparticelle sono creati per escludere selettivamente immunoglobuline alta abbondanza e albumina, e contemporaneamente catturare proteine ​​e peptidi più piccoli e la loro concentrazione fino a 100 volte a seconda del volume di partenza.

Il nostro gruppo ha identificato una serie di piccoli coloranti organici che possono agire con successo esche molecolari ad alta affinità per le proteine ​​e peptidi. Binding protein-dye è pensato per essere a causa di una combinazione di interazione idrofobica ed elettrostaticas. Gli anelli aromatici sulla colorante interleave con proteine ​​tramite tasche idrofobiche sulla superficie della proteina ^11.

Le esche, a seconda della loro chimica, mostrano una particolare affinità per le classi selezionate di analiti. Le esche sono in concorrenza con le proteine ​​di trasporto, come l'albumina, per le proteine ​​o peptidi. Il peso proteine ​​/ peptidi a basso peso molecolare diventano intrappolati nella particella. Proteine ​​di elevato peso molecolare come albumina e immunoglobuline viene impedito di entrare particella a causa della capacità setacciatura dovuta al poro restrittiva del idrogel ¹¹ (Figura 1).

Nanoparticelle idrogel sono sintetizzati per precipitazione polimerizzazione iniziata da persolfato di ammonio ^11. N-isopropilacrilammide (NIPAM), co-monomeri di acido acrilico (AAC) e allilamina (AA) e cross-linker N, N'-Methylenebisacrylamide (BIS) sono autorizzati a reagire a 70 ° C per 6 ore in condizioni diluite ¹1, 13. L'affinità di legame ad alta percentuale proteica di poli (N isopropilacrilammide-co-acrilico-acido) (poli (NIPAM-co-AAC) nanoparticlesis raggiunto da covalentemente incorporando coloranti-aminoacidi contenenti (es., Coloranti sulfonatedanthraquinonetriazine) nelle nanoparticelle attraverso una reazione ammidazione eseguita in solventi acquosi o organici a seconda delle caratteristiche idrofiliche / idrofobiche dei coloranti ^{11, 13.} sostituzione nucleofila dei gruppi amminici della nanoparticella con l'atomo di cloruro di un colorante anthraquinonetriazine è utilizzata per creare-colorante contenente poli (NIPAM -CO-allilamina) (AA) nanoparticelle ^{11, 12.} Un processo di polimerizzazione in due fasi viene utilizzato per creare nanoparticelle idrogel che contengono un guscio esterno di acido vinylsulfonic (VSA) ^{11, 13.}

Nanoparticelle idrogel possono essere applicati a vari fluidi biologici, compreso il sangue intero, plasma, siero, liquido cerebrospinale, il sudore e l'urina. In un passo, in soluzione, il nanoparticles eseguire una rapida (entro pochi minuti) il sequestro e la concentrazione di basso peso molecolare analiti ^{10, 11, 13, 15-18.} Le proteine ​​sono successivamente eluiti dalle nanoparticelle e rilevati mediante Western Blotting ^19-21, spettrometria di ^{10, 11, 13, 15, 18, ​​22} di ^{massa, 23,} saggi immunologici / ELISA ^{10, 11, 15, 18,} ​​o fase inversa proteina microarray ^{16, 24} saggi. Le nanoparticelle funzionalizzate con esche chimiche, e presentando un nucleo o nucleo shell architettura, la cattura e concentrano le proteine ​​in base alle proprietà fisico-chimiche esca / shell. Diversi coloranti incorporati nelle nanoparticelle saranno quindi catturare diversi sottoinsiemi di proteine ​​con diversa efficacia basata sull'affinità colorante, il pH della soluzione, e la presenza / assenza di competere proteine ​​ad alto abbondante ^13. Inoltre, la quantità di nanoparticelle in rapporto al volume della soluzione influenzerà la resa di proteine ​​dalle nanoparticelle. Questi aspetti diidrogel nanoparticelle raccolta sono dimostrata utilizzando tre diverse esche nanoparticelle per le proteine ​​raccolta di campioni di plasma che contengono elevate quantità di proteine, e da campioni di urina che in genere non contengono grandi quantità di proteine. In questo protocollo dimostriamo la raccolta e concentrazione fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa) da campioni di plasma mediante poli (NIPAM-co-AAC), Poli (NIPAM / colorante) e nanoparticelle core-shell (Poly (NIPAM-co-VSA)) . Poli (NIPAM / colorante) nanoparticelle sono mostrati a concentrarsi Mycobacterium antigene specie che è stato aggiunto a campioni di urina umana, per imitare Mycobacterium tuberculosis individui infetti.

Protocollo

Plasma umano e nelle urine sono stati raccolti da donatori volontari sani, con il consenso informato scritto, seguendo George Mason University Institutional Review Board protocolli approvati. I donatori sono stati equamente distribuiti tra maschi caucasici e femmine di età compresa tra 25 e 42 campioni sono stati analizzati individualmente tra e non sono stati riuniti.

1 nanoparticelle Elaborazione di siero o plasma

Basso potenziale di biomarcatori abbondanti nel plasma vengono catturati, in soluzione, con nanoparticelle idrogel. Le particelle vengono aggiunti al plasma, incubato, separato per centrifugazione, lavato, e le proteine ​​vengono eluite catturate. Le proteine ​​eluite vengono essiccati in corrente di azoto a valle per il sequenziamento spettrometria di massa e l'identificazione.

1. Diluire 500 ml di siero 1: 2 con 50 mM TrisHCl pH 7 (siero ml 500 + 500 microlitri TrisHCl) in una provetta.
2. Aggiungere 500 ml di poli (NIPAM / AAC) nucleo nanoparticoli. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso. Rimuovere e scartare il surnatante.
4. Aggiungere 500 microlitri tiocianato di sodio (25 mm) al pellet. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte.
5. Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga con rotore ad angolo fisso. Rimuovere e scartare il surnatante.
6. Aggiungere 500 ml di acqua MilliQ al pellet nanoparticella. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte.
7. Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga con rotore ad angolo fisso. Rimuovere e scartare il surnatante.
8. Preparare il tampone di eluizione fresco: Aggiungere 700 ml di acetonitrile idrossido di ammonio 300 microlitri in una provetta pulita. Attenzione: idrossido di ammonio è corrosivo. Usare con ventilazione adeguata. Nota: Il buffer di eluizione devono essere prepared immediatamente prima dell'uso. Non conservare il tampone di eluizione.
9. Aggiungere 300 ml di tampone di eluizione al pellet nanoparticelle. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
10. Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga con rotore ad angolo fisso. Rimuovere e conservare l'eluato in una, provetta etichettata e pulita.
11. Ripetere i passaggi 1,9-1,10. Unire i due eluati in una provetta.
12. Essiccare gli eluati sotto flusso di azoto in un collettore evaporatore azoto a 42,1 ° C, con flusso d'aria impostata a 8 (Figura 2F).
13. Conservare l'eluato essiccata a temperatura ambiente per O / N stoccaggio, oa -20 ° C per la conservazione a lungo termine, prima della spettrometria di massa, western blotting, o test ELISA (opzionale).

2. nanoparticelle Trattamento dei Campioni di urina

L'urina normale contiene meno di 30 mg / dl e proteinemeno di 1+ sangue. Tuttavia, molte malattie / condizioni possono alterare i normali livelli di proteine ​​nelle urine e del sangue. Per aiutare a determinare il volume ottimale di nanoparticelle da aggiungere al campione di urine, un esame delle urine viene eseguito prima di nanoparticelle di raccolta. Possono esistere biomarcatori urine in concentrazioni estremamente basse, che possono richiedere l'ottimizzazione del rapporto tra nanoparticelle di volume urinario. Questa procedura descrive nanoparticelle raccolta di campioni di urine per la valle analisi western blot.

1. Raccogliere campioni di urina in un bicchiere di plastica pulito, asciutto. È richiesto un volume minimo di 22 ml. Urine Conservare i campioni a -80 ° C fino al momento di analizzare.
2. Scongelare l'urina congelata a temperatura ambiente oa 4 ° CO / N. Mescolare brevemente su vortex. Versare almeno 22 ml di urina in una provetta di polipropilene fondo conico da 50 ml.
3. Spin urine in una centrifuga con rotore swing-out a 3.700 xg per 15 min. Decantare l'urina, senza disturbare il pellet, in un ambiente pulito polypr fondo conico da 50 mltubo opylene. Eliminare il pellet.
4. Eseguire l'analisi delle urine con un multi-analita "urine con stick reattivo" striscia reagente. Nota: conservare le strisce reagenti in un contenitore ermeticamente chiuso lontano dalla luce diretta del sole e dall'umidità ^{17, 18.}
   1. Posare la striscia reagente, a faccia in su, su un fazzoletto di carta pulito e asciutto.
   2. Utilizzare una pipetta monouso per aspirare 1 ml di urina preparato al punto 2.3.
   3. Impostare un timer per 2 min, ma non avviarlo. Erogare rapidamente 1 - 2 gocce di urina su ogni pad prova della striscia reagente. Avviare immediatamente il timer. Nota: Non immergere la striscia reagente direttamente nel contenitore urine. Gli indicatori colorante / chimici nella striscia reagente possono potenzialmente percolare fuori della striscia reagente nel contenitore urine.
   4. Al tempo indicato sul flacone delle strisce di reagente, registrare i risultati qualitativi per i vari analiti sulla striscia reagente confrontando il colore delle singole strisce reagenti alla corrispondente indica codice coloretori sul contenitore del reagente. Tipici normali risultati delle urine sono: (normale o negativo) per il sangue, proteine, leucociti, nitriti, glucosio, chetoni, bilirubina e urobilinogeno; Urine pH (5,5-7,0); peso specifico (1,001-1,020). Nota: Alti livelli di proteine ​​in un campione di urina possono competere con la proteina di interesse per i siti sulle nanoparticelle vincolanti. Per massimizzare la raccolta di proteine ​​con nanoparticelle, l'/ volume di urina volume di nanoparticelle può essere regolato sia per limitare la concorrenza da proteine ​​di alta abbondanza, o può essere ottimizzato per raccogliere le proteine ​​presenti in concentrazioni molto basse. Se il valore di proteine ​​nelle urine è 1+ o superiore, aggiungere 2x volumi di nanoparticelle nella fase 2.5. Se l'analita di interesse è molto basso abbondante proteina, può essere necessario aumentare il volume delle nanoparticelle fino a 2 ml (Figura 3).
5. Trasferire 20 ml di urina chiarito dal punto 2.3 in una provetta da 50 ml pulito polipropilene fondo conico. Nondisturbare eventuali detriti / pellet che possono essere nel fondo della provetta urina. Aggiungere 200 ml di nanoparticelle per il campione di urina 20 ml. Mescolare brevemente su vortex. Nota: Se il valore di proteine ​​nelle urine è 1+ o superiore, aggiungere 400 ml di nanoparticelle a 20 ml di urina.
6. Incubare la miscela urine / nanoparticelle per 30 minuti a temperatura ambiente, senza che a dondolo / miscelazione.
7. Centrifugare la sospensione urina / nanoparticelle in una centrifuga dotata di un rotore oscillante a 3.700 xg per 10 min. Nota: se un pellet non è visibile Dopo la centrifugazione, girare i campioni per un ulteriore 2 - 7 min.
8. Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere acqua 500 microlitri MilliQ al pellet nanoparticelle.
9. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. Trasferire la soluzione di nanoparticelle di un ambiente pulito 1,5 ml provetta.
10. Spin le nanoparticelle in una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso a 16.100 xg per 10 min. Nota: se un pellet non è fol visibileguendo centrifugazione, girare i campioni per un ulteriore 2-7 min.
11. Rimuovere e scartare il surnatante.
12. Ripetere i punti 2.8 e 2.11 (due volte) con 200 ml 18 MilliQ acqua per lavare le nanoparticelle.
13. Preparare il tampone di eluizione fresco: Aggiungere 970 ml di acetonitrile idrossido di ammonio 30 ml in una provetta pulita. Attenzione: idrossido di ammonio è corrosivo. Usare con ventilazione adeguata. Nota: Il buffer di eluizione deve essere preparata immediatamente prima dell'uso. Non conservare il tampone di eluizione.
14. Aggiungere 20 microlitri tampone di eluizione al pellet nanoparticelle. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
15. Spin i campioni di nanoparticelle a 16.100 xg per 10 min. Rimuovere e conservare il surnatante in una provetta pulita da microcentrifuga da 1,5 ml. Non disturbare il pellet nanoparticelle. Eliminare il pellet nel rischio biologico spazzatura.
16. Mettere i campioni in un rack in una cappa. Aprire i tappi e incUbate a temperatura ambiente per 30 min. In alternativa, posizionare i campioni sotto flusso di azoto a 40 ° C fino a secco (1 - 2 ore).
17. Aggiungere 15 microlitri tampone Tris-glicina SDS (2x) per i campioni. Riscaldare a 100 ° C in un blocco a calore secco per 5 min con i tappi aperti o fino a quando il volume lasciato nel tubo non è più di 20 microlitri. Nota: non utilizzare un bagno di acqua bollente. L'umidità dal bagno di acqua impedirà l'evaporazione del buffer.
18. Posizionare il tappo sui tubi. Rimuovere i tubi dal blocco di calore. Il campione può essere conservato a -80 ° C o utilizzato immediatamente a valle per l'analisi western blot.

Risultati

Hydrogel nanoparticelle Dimensioni e uniformità

Poli (NIPAM-AAC) le particelle sono state prodotte con altissima resa e riproducibilità tra e all'interno di lotti. Le particelle hanno una buona stabilità colloidale a RT per il tempo necessario per l'acquisizione, la memorizzazione e l'eluizione delle proteine ​​(almeno 48 ore), e nanoparticelle precipitazione non è stato osservato (Figura 1) ^11. La stabilità colloidale può es...

Discussione

Rilevanza clinica

Un campione di siero o plasma è pensato per contenere bassa abbondanza di proteine ​​e peptidi in grado di fornire una ricca fonte di informazioni per quanto riguarda lo stato dell'organismo nel suo complesso circolante. Nonostante la promessa di proteomica del siero, ci sono tre barriere fisiologiche fondamentali e gravi contrastare scoperta di biomarcatori e la traduzione di beneficio clinico ^{10, 11, 16, 25.}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
hydrogel nanoparticles	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water			Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50mM pH7.0	VWR	IC816116	50mM, pH 7
Acetonitrile	BDH	BDH1103-4LP	available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH	BDH	BDH3014	available from VWR, assayed at 28-30% NH3
sodium thiocyanate 25mM	Acros Organics	419675000	for serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips	Siemens	2161	for urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	use at room temperature to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block	Barnstead	11-715-125DQ	do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold	Organomation Associates	Microvap118	for serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor	Sorvall	Legend series	50ml tube capacity, rcf 3700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor	Eppendorf	5424	1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22	with screw caps for urine samples
1.5ml microcentrifuge tubes	Eppendorf	22363204
Disposable plastic transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	at least 1ml capacity
Vortex mixer	Fisher Scientific	50-949-755
Timer	Fisher Scientific	S04782	seconds/minutes