Hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância

Resumo

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Resumo

Descoberta de biomarcadores Novel desempenha um papel crucial no fornecimento de detecção mais sensível e específico para a doença. Infelizmente muitos biomarcadores baixa abundância que existem em fluidos biológicos não pode ser facilmente detectada com a espectrometria de massa ou imunoensaios, pois eles estão presentes em concentrações muito baixas, são instáveis, e muitas vezes são mascarados por proteínas de abundância elevada, tais como albumina ou imunoglobulina. Bait contendo poli (N-isopropilacrilamida) (NiPAM) nanopartículas à base são capazes de superar essas barreiras fisiológicas. Num passo que eles são capazes de captar, concentrar e preservar biomarcadores de fluidos corporais. Analitos de baixo peso molecular entrar no núcleo da nanopartícula e são capturados por diferentes corantes químicos orgânicos, os quais actuam como iscos de proteína com elevada afinidade. As nanopartículas são capazes de se concentrar as proteínas de interesse em várias ordens de magnitude. Este factor de concentração é suficiente para aumentar o nível de proteína de tal modo que as proteínas estão dentro dolimite de detecção de corrente de espectrómetros de massa, transferência de western, e imunoensaios. As nanopartículas podem ser incubadas com uma variedade de fluidos biológicos e que são capazes de enriquecer grandemente a concentração de proteínas de baixo peso molecular e de péptidos e excluindo albumina e outras proteínas de alto peso molecular. Os nossos dados mostram que uma amplificação de 10.000 vezes na concentração de um analito particular, pode ser conseguido, permitindo que a espectrometria de massa e ensaios imunológicos para detectar biomarcadores anteriormente indetectáveis.

Introdução

Apesar da conclusão do seqüenciamento do genoma humano, um progresso significativo não foi alcançado na identificação de biomarcadores preditivos de doença em estágio inicial, ou que se correlacionam com os resultados terapêuticos, ou prognóstico ^1. Uma das razões para esta falta de progresso é que muitos biomarcadores potencialmente significativas existem em uma concentração abaixo do limite de detecção de espectrometria de massa convencional e outras plataformas de descoberta de biomarcadores. Espectrometria de massa (MS) e monitorização de reacções múltiplas (MRM) tem uma sensibilidade de detecção, tipicamente maior do que 50 ng / ml, enquanto a maioria dos analitos medido por imunoensaios em uma queda de laboratório clínico no intervalo entre 50 pg / ml e 10 ng / mL . Isto significa que muitos biomarcadores, particularmente na fase inicial de uma doença que não pode ser detectado por MS convencional e MRM ^2. Além disso, a presença de proteínas de elevada abundância, tais como albumina e imunoglobulina em fluidos biológicos complexos, frequentemente mascarar por mil vezes excess baixa abundância, proteínas de baixo peso molecular e de péptidos ^{3, 4.} Por esta razão várias etapas de preparação da amostra é necessária antes da espectrometria de massa e sequenciação de identificação. Um tal passo preparatório emprega a depleção de proteínas de alta abundância com colunas de depleção disponíveis comercialmente ^5-8. Infelizmente, este passo leva à diminuição do rendimento de biomarcadores candidatos porque eles são muitas vezes não covalentemente associada com proteínas transportadoras que estão a ser removidos. Um outro desafio é representado pela estabilidade dos biomarcadores candidatos ex-vivo, uma vez que as amostras são recolhidas. As proteínas são sujeitas a degradação por proteases endógenas ou exógenas ^9. Nanopartículas de hidrogel podem ultrapassar estes desafios críticos, amplificando a concentração biomarcador putativo para um nível dentro da gama do ensaio, ao mesmo tempo proteger a proteína de degradação ^10-13.

É importante notar ªLMW em proteínas no sangue são uma mistura de proteínas intactas pequenas, bem como fragmentos de proteínas grandes. Proteínas derivadas de tecido superior a 60 kDa são demasiado grandes para entrar passivamente o fluxo de sangue através da membrana basal vascular, mas eles podem ser representados no sangue como péptidos ou fragmentos de proteínas ^14. Nosso objetivo é medir novos circulando biomarcadores que podem ser candidatos para a detecção precoce da doença, a estratificação dos pacientes para a terapia, e monitorar a resposta à terapia. Nossos nanopartículas são criados para excluir selectivamente imunoglobulinas e albumina de abundância alta e, simultaneamente, a captura de proteínas e péptidos mais pequenos e concentrá-los até 100 vezes dependendo do volume de partida.

O nosso grupo identificado um conjunto de pequenas corantes orgânicos que podem funcionar com sucesso como engodos moleculares de elevada afinidade para proteínas e péptidos. Ligação da proteína-corante é provavelmente devido a uma combinação de interacção hidrofóbica e electrostáticos. Os anéis aromáticos do corante intercalar com proteínas através de bolsas hidrofóbicas na superfície de proteínas ^11.

Os iscos de acordo com a química, mostram uma afinidade específica para as classes de analitos seleccionados. Os iscos competir com as proteínas transportadoras, tais como albumina, para as proteínas ou péptidos. As de baixo peso molecular de proteínas / péptidos tornam-se aprisionados na partícula. Proteínas de alto peso molecular tais como albumina e imunoglobulinas são impedidas de entrar na partícula, devido à capacidade de crivagem, devido ao poro restritiva do hidrogel ¹¹ (Figura 1).

Nanopartículas de hidrogel são sintetizados por polimerização a precipitação iniciada por persulfato de amónio ^11. N-isopropilacrilamida (NiPAM), co-monómeros de ácido acrílico (AAC) e alilamina (AA) e N, N'-metilenobisacrilamida (BIS) de reticulação são deixados reagir a 70 ° C durante 6 h em condições de diluição ¹1, 13. A afinidade de ligação da proteína de poli (N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico) (poli (NiPAM-co-AAc) nanoparticlesis conseguida por ligação covalente incorporando corantes contendo amino (isto é. Sulfonatedanthraquinonetriazine, corantes) em que as nanopartículas através uma reacção de amidação realizada em solventes aquosos ou orgânicos, dependendo das características hidrofóbicas / hidrofílicas dos corantes ^{11, 13.} substituição nucleofílica dos grupos amina na nanopartículas com o átomo de cloro de um corante anthraquinonetriazine é utilizado para criar poli que contém o corante (NiPAM -CO-alilamina) (AA) nanopartículas ^{11, 12.} Um processo de polimerização em duas etapas é utilizado para criar as nanopartículas de hidrogel contendo um invólucro exterior de ácido vinilsulfónico (VSA) ^{11, 13.}

Nanopartículas de hidrogel pode ser aplicado a vários fluidos biológicos, incluindo o sangue total, plasma, soro, fluido cefalorraquidiano, suor e urina. Em uma etapa, em solução, o nanoparticles realizar uma rápida (dentro de minutos), a fixação ea concentração de analitos de baixo peso molecular ^{de 10, 11, 13, 15-18.} As proteínas são seguidamente eluídas das nanopartículas e detectado utilizando a técnica Western Blot ^19-21, espectrometria de massa de ^{10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23,} imunoensaios / ELISA ^{10, 11, 15, 18,} ​​ou proteína de fase inversa microarray ^{16, 24} ensaios. As nanopartículas funcionalizadas com isca química, e apresentando um núcleo ou núcleo shell arquitetura, captura e concentrar as proteínas com base nas propriedades físico-químicas isca / shell. Diferentes corantes incorporados nas nanopartículas, por conseguinte, irá capturar diferentes subconjuntos de proteínas com base na eficiência de afinidade de corante, pH da solução, e a presença / ausência de proteínas de ^alto-13 competem variando abundante. Além disso, a quantidade de nanopartículas em relação ao volume da solução irá afectar a produção de proteína a partir das nanopartículas. Estes aspectoscolheita das nanopartículas de hidrogel são demonstradas utilizando três iscas nanopartículas diferentes para proteínas de colheita de amostras de plasma que contêm quantidades elevadas de proteína, e a partir de amostras de urina, que tipicamente não contêm grandes quantidades de proteínas. Neste protocolo, demonstrar a colheita concentrando e factor de necrose tumoral alfa (TNFa) a partir de amostras de plasma utilizando poli (NiPAM-co-AAc), poli (NiPAM / corante), e nanopartículas de casca Core- (poli (NiPAM-co-VSA)) . Poli (NiPAM / corante) nanopartículas são mostrados para concentrar antigénio espécies de Mycobacterium que foi adicionado a amostras de urina humana, para imitar os indivíduos infectados pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis.

Protocolo

O plasma humano e urina foi coletada a partir de doadores voluntários saudáveis, com consentimento informado por escrito, seguindo de Revisão Institucional da Universidade George Mason Conselho aprovou protocolos. Os doadores foram distribuídos igualmente entre homens brancos e mulheres entre as idades de 25 e 42 amostras foram analisadas individualmente e não foram reunidas.

1. nanopartículas de Processamento de amostras de soro ou plasma

Baixas biomarcadores potenciais abundante no plasma são capturados, em solução, com nanopartículas de hidrogel. As partículas são adicionadas ao plasma, incubadas, separadas por centrifugação, lavadas, e as proteínas capturadas são eluídas. As proteínas eluidas são secos sob um fluxo de azoto durante a jusante sequenciação e espectrometria de massa de identificação.

1. Dilui-se 500 ul de soro de 1: 2, com 50 mM Tris-HCl de pH 7 (500 mL de soro + 500 ul Tris-HCl), em um tubo de microcentrífuga.
2. Adicionar 500 mL de poli (NiPAM / AAC) núcleo NanOpartigos. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
3. Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo. Remova e descarte o sobrenadante.
4. Adicionar 500 ul de tiocianato de sódio (25 mM) para o sedimento. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes.
5. Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga com um rotor de ângulo fixo. Remova e descarte o sobrenadante.
6. Adicionar 500 mL de água MilliQ para o sedimento de nanopartículas. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes.
7. Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga com um rotor de ângulo fixo. Remova e descarte o sobrenadante.
8. Preparar tampão de eluição fresco: Adicionar 700 ul de acetonitrilo e 300 ul de hidróxido de amónio num tubo limpo. Atenção: hidróxido de amônio é corrosivo. Utilize com ventilação adequada. Nota: O tampão de eluição deve ser prepared imediatamente antes da utilização. Não guarde o tampão de eluição.
9. Adicionar 300 ul de tampão de eluição à pelete de nanopartículas. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
10. Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga com um rotor de ângulo fixo. Remova e guarde o fluido em um tubo de microcentrífuga rotulado limpo.
11. Repita os passos 1,9-1,10. Combine as duas eluatos em um tubo de microcentrífuga.
12. Secam-se os produtos de eluição sob fluxo de azoto, em um evaporador colector de azoto a 42,1 ° C, com um fluxo de ar ajustado para 8 (Figura 2F).
13. Armazenar o eluato secas à temperatura ambiente durante ó armazenamento / N, ou a -20 ° C para armazenamento a longo prazo, antes da espectrometria de massa, transferência de western, ensaios de ELISA ou (opcional).

2. nanopartículas Processamento das amostras de urina

A urina normal contém menos do que 30 mg / dl e proteínamenos do que 1 + no sangue. No entanto, muitas doenças / condições podem alterar os níveis normais de proteína na urina e no sangue. Para ajudar a determinar o volume óptimo de nanopartículas para adicionar à amostra de urina, uma análise de urina é realizada antes da colheita de nanopartículas. Biomarcadores de urina podem existir em concentrações extremamente baixas, o que pode exigir optimizar a proporção de nanopartículas com o volume de urina. Este processo descreve a colheita de amostras de urina de nanopartículas para análise de Western blot a jusante.

1. Coletar amostras de urina em um ambiente limpo, copo de plástico seco. Um volume mínimo de 22 ml é necessária. Urina loja amostras à temperatura de -80 ° C até estar pronto para a análise.
2. Descongele a urina congelada à temperatura ambiente ou a 4 ° CO / N. Misture brevemente em um misturador de vórtice. Despeje pelo menos 22 ml de urina para um tubo de polipropileno de fundo cónico de 50 ml.
3. Girar a urina numa centrífuga com um rotor basculante para fora a 3.700 xg durante 15 min. Decantar a urina, sem perturbar o sedimento, em um POLYPR fundo cónico de 50 ml limpotubo opylene. Descarte o sedimento.
4. Realizar exame de urina usando uma multi-analito "vareta de urina" tira reagente. Nota: guarde as tiras reagentes em um recipiente bem fechado longe da luz solar e umidade ^{17, 18} direto.
   1. Coloque a tira reagente, virada para cima, sobre uma toalha de papel limpo e seco.
   2. Usar uma pipeta descartável para aspirar 1 ml de urina, preparado no passo 2.3.
   3. Defina um temporizador para 2 min, mas não iniciá-lo. Dispensar rapidamente 1-2 gotas de urina em cada almofada de teste da tira reagente. Iniciar imediatamente o timer. Nota: Não mergulhe a tira reagente diretamente no recipiente de urina. Os indicadores de tintura / química na fita reagente pode, potencialmente, vaza da tira reagente para o recipiente de urina.
   4. No tempo indicado na embalagem tira reagente, gravar os resultados qualitativos para os vários analitos sobre a tira reagente, comparando a cor das fitas reagentes individuais indica o código de cores correspondentedores no recipiente de reagente. Resultados de urina normais típicas são: (normal ou negativa) para o sangue, proteína, leucócitos, nitrito, glucose, cetona, bilirrubina, e urobilinogénio; Urina pH (5,5-7,0); gravidade específica (1,001-1,020). Nota: Os níveis elevados de proteínas numa amostra de urina, podendo competir com a proteína de interesse para os locais de ligação sobre as nanopartículas. Para maximizar a colheita de proteínas com nanopartículas, a / volume de urina de volume de nanopartículas pode ser ajustado para qualquer competição limite de proteínas de alta abundância, ou pode ser otimizado para colher as proteínas que existem em concentrações muito baixas. Se o valor de proteínas na urina é 1 + ou maior, adicionar volumes 2x de nanopartículas no passo 2.5 abaixo. Se o analito de interesse é uma proteína muito baixo abundante, pode ser necessário aumentar o volume de nanopartículas até 2 ml (Figura 3).
5. Transferir 20 ml de urina clarificado do passo 2.3 em 50 mL de um tubo de polipropileno de fundo cónico limpo. Nãoperturbar quaisquer detritos / sedimento que pode ser no fundo do tubo de urina. Adicionar 200 ul de nanopartículas para os 20 ml da amostra de urina. Misture brevemente em um misturador de vórtice. Nota: Se o valor de proteínas na urina é 1 + ou maior, adicionar 400 mL de nanopartículas a 20 ml de urina.
6. Incubar a mistura de urina / nanopartículas durante 30 min à temperatura ambiente, sem balançar / mistura.
7. Girar a suspensão de urina / nanopartículas numa centrífuga equipada com um rotor basculante para fora a 3.700 xg durante 10 min. Nota: Se uma bolinha não é seguir a centrifugação visível, girar as amostras para um adicional de 2-7 min.
8. Remova e descarte o sobrenadante. Adicionar 500 mL de água MilliQ para o sedimento de nanopartículas.
9. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transferir a solução de nanopartículas de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo.
10. Rodar as nanopartículas numa centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo a 16.100 xg durante 10 min. Nota: Se uma bolinha não é visível folmugido centrifugação, girar as amostras para um adicional de 2-7 min.
11. Remova e descarte o sobrenadante.
12. Repita os passos 2.8 e 2.11 (duas vezes) com 200 ul de 18 MiliQ de água para lavar as nanopartículas.
13. Preparar tampão de eluição fresco: Adicionar 970 ul de acetonitrilo a 30 mL de hidróxido de amónio num tubo limpo. Atenção: hidróxido de amônio é corrosivo. Utilize com ventilação adequada. Nota: O tampão de eluição deve ser preparado imediatamente antes da utilização. Não guarde o tampão de eluição.
14. Adicionar 20 ul de tampão de eluição à pelete de nanopartículas. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
15. Gire as amostras de nanopartículas a 16.100 xg por 10 min. Retire e guarde o sobrenadante em um, 1,5 ml tubo de microcentrífuga limpo. Não perturbar o pellet de nanopartículas. Descarte a pelota no lixo de risco biológico.
16. Colocar as amostras em um rack em um exaustor química. Abra as tampas e incUbaté à TA durante 30 min. Em alternativa, colocar as amostras de acordo com o fluxo de azoto a 40 ° C até secar (1 - 2 horas).
17. Adicionar 15 ul de tampão de amostra de Tris-glicina SDS (2x) para as amostras. Aquece-se a 100 ° C num bloco de aquecimento a seco durante 5 minutos com as tampas abertas, ou até que o volume deixado no tubo não é mais de 20 ul. Nota: não use um banho de água fervente. A humidade do banho de água irá evitar a evaporação do tampão.
18. Coloque a tampa sobre os tubos. Retire os tubos do bloco de aquecimento. A amostra pode ser armazenada a -80 ° C ou usado imediatamente para a análise de Western blot a jusante.

Resultados

Hidrogel nanopartículas tamanho e uniformidade

Poli (NiPAM-AAC) partículas foram produzidas com um rendimento extremamente elevado e reprodutibilidade entre e dentro dos grupos. As partículas têm muito boa estabilidade coloidal à TA durante o tempo necessário para a recolha, o armazenamento, e a eluição das proteínas (pelo menos 48 horas), e precipitação das nanopartículas não foi observado (Figura 1) ^11. A estabilidade coloidal pode ...

Discussão

Relevância Clínica

Uma amostra de soro ou plasma é pensado para conter baixa abundância de proteínas e peptídeos que podem proporcionar uma fonte rica de informações sobre o estado do organismo como um todo em circulação. Apesar da promessa de proteômica de soro, há três barreiras fisiológicas fundamentais e graves dificultando a descoberta de biomarcadores e tradução para o benefício clínico ^{10, 11, 16, 25.}

1. biomar...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
hydrogel nanoparticles	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water			Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50mM pH7.0	VWR	IC816116	50mM, pH 7
Acetonitrile	BDH	BDH1103-4LP	available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH	BDH	BDH3014	available from VWR, assayed at 28-30% NH3
sodium thiocyanate 25mM	Acros Organics	419675000	for serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips	Siemens	2161	for urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	use at room temperature to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block	Barnstead	11-715-125DQ	do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold	Organomation Associates	Microvap118	for serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor	Sorvall	Legend series	50ml tube capacity, rcf 3700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor	Eppendorf	5424	1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22	with screw caps for urine samples
1.5ml microcentrifuge tubes	Eppendorf	22363204
Disposable plastic transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	at least 1ml capacity
Vortex mixer	Fisher Scientific	50-949-755
Timer	Fisher Scientific	S04782	seconds/minutes