Гидрогель наночастиц Заготовка плазмы или мочи для обнаружения Низкие Белки изобилии

Резюме

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Аннотация

Роман поиска биомаркеров играет решающую роль в обеспечении более чувствительным и специфичным обнаружению болезни. К сожалению, многие низкой численности биомаркеров, которые существуют в биологических жидкостях, не могут быть легко обнаружены с масс-спектрометрией или иммунологических, потому что они присутствуют в очень низкой концентрации, лабильны, и часто замаскированных высокой численности белки, такие как альбумин или иммуноглобулин. Приманка, содержащий поли (N-изопропилакриламид) (NIPAm) наночастицы на основе способны преодолеть эти физиологические барьеры. В одном шаге они способны захватить, сосредоточиться и сохранить биомаркеров из жидкостей организма. Низкомолекулярные анализируемые вес введите ядро ​​наночастицы и захвачены различных органических химических красителей, которые действуют как высокоаффинные белковых приманок. Наночастицы способны концентрировать белки интересов на несколько порядков. Этот коэффициент концентрации достаточно, чтобы повысить уровень белка таким образом, что белки находятся в пределахПредел обнаружения текущих масс-спектрометров, вестерн-блоттинга и иммунологических. Наночастицы могут быть инкубировали с множеством биологических жидкостях, и они способны значительно обогатить концентрацию белков и пептидов с низкой молекулярной массой, исключая альбумин и другие белки с высоким молекулярным весом. Наши данные показывают, что 10000 раз усиление в концентрации конкретного анализируемого вещества может быть достигнуто, позволяя масс-спектрометрии и иммунологические анализы для обнаружения ранее неопределяемый биомаркеров.

Введение

Несмотря на завершение в ДНК генома человека, значительный прогресс не был достигнут в идентификации биомаркеров, прогнозирования ранних стадиях заболевания, или, что коррелирует с терапевтического результата, или прогноза ^1. Одной из причин такого отсутствия прогресса в том, что многие потенциально значительные биомаркеры существуют в концентрации ниже предела обнаружения обычной масс-спектрометрии и других платформ поиска биомаркеров. Масс-спектрометрия (МС) и множественный Мониторинг реакции (МРМ) имеют чувствительность обнаружения обычно больше, чем 50 нг / мл, а большинство анализируемых веществ измеряется с помощью иммуноанализа в клинической лаборатории падения в пределах от 50 пг / мл и 10 нг / мл . Это означает, что многие биомаркеры, особенно в начальной стадии болезни, не могут быть обнаружены с помощью обычного МС и MRM ^2. Кроме того наличие высокого обилия белков, таких как альбумин и иммуноглобулин в сложных биологических жидкостей часто маскируют путем млрд раза отлESS низкой численности, низкомолекулярные белки и пептиды ^{3, 4.} По этой причине несколько образцов подготовительные шаги необходимо перед масс-спектрометрии секвенирования и идентификации. Одним из таких подготовительным шагом использует истощение высокого обилия белков с коммерчески доступных истощения столбцов ^5-8. К сожалению, этот шаг приводит к снижению выхода кандидатов биомаркеров, потому что они часто не ковалентно связаны с белками-носителями, которые удаляются. Еще одна проблема представлена ​​стабильности кандидатов биомаркеров экс-Vivo после того, как образцы собираются. Белки подвержены деградации эндогенных или экзогенных протеаз ^9. Гидрогелевые наночастицы могут преодолеть эти критические проблемы путем амплификации предполагаемого концентрацию биомаркеров до уровня в интервале анализа, при одновременной защите от деградации белка ^10-13.

Важно отметить йна LMW белков в крови представляют собой смесь мелких интактных белков, а также фрагменты больших белков. Тканевые происхождения белки больше, чем 60 кДа слишком велики, чтобы пассивно проникать в кровеносную систему через базальную мембрану сосудов, но они могут быть представлены в кровь в виде пептидов или белковых фрагментов ^14. Наша цель заключается в измерении новых циркулирующих биомаркеров, которые могут быть кандидатами для раннего выявления заболевания, стратификации пациентов для терапии, и мониторинга ответа на терапию. Наши наночастицы создаются, чтобы выборочно исключить высокое содержание иммуноглобулины и альбумин, в то же время захвата меньшие белки и пептиды, и их концентрации до 100-кратного в зависимости от исходного объема.

Наша группа определила набор небольших органических красителей, которые могут успешно действовать как высокоаффинные молекулярные приманки для белков и пептидов. Белок-краситель связывания, как полагают, обусловлено сочетанием гидрофобных и электростатическим взаимодействиемс. Ароматические кольца на красителе чередовать с белками через гидрофобных карманов на поверхности белка ^11.

Приманки, в зависимости от их химии, показывают особое сродство для выбранных классов веществ. Приманки конкурировать с белками-носителями, такими как альбумин, для белков или пептидов. В низкомолекулярные белки / пептиды в ловушку частицы. С высокой молекулярной массой белки, такие как альбумин и иммуноглобулина предотвратить попадание частицы в связи с возможностью просеивания в связи с ограничительной поры гидрогеля ¹¹ (рисунок 1).

Гидрогелевые наночастицы синтезируют полимеризацией, инициированной осадков персульфата аммония ^11. N-изопропилакриламид (NIPAm), со-мономеров акриловой кислоты (AAC) и аллиламина (АА) и сшивающего агента N, N'-метиленбисакриламид (BIS) подвергают взаимодействию при 70 ° С в течение 6 ч в разбавленных условиях ¹1, 13. Связывание с высоким содержанием белка сродство поли (N-изопропилакриламид-CO-акриловой кислоты) (поли (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis достигнуто путем ковалентного включающий аминокислоты, содержащие красители (т.е.., Sulfonatedanthraquinonetriazine красители) в наночастицах с помощью амидирование реакцию проводят в водных или органических растворителей в зависимости от гидрофильных / гидрофобных характеристик красителей ^{11, 13.} нуклеофильного замещения аминогрупп в наночастицы с атомом хлорида из anthraquinonetriazine красителя используется для создания красителей, содержащих поли (NIPAm оо-Аллиламин) (AA) наночастиц ^{11, 12.} процесс двухступенчатый полимеризации используется для создания гидрогеля наночастицы, содержащие внешнюю оболочку винилсульфокислота (VSA) ^{11, 13.}

Гидрогелевые наночастицы могут быть применены в различных биологических жидкостей, в том числе цельной крови, плазмы, сыворотки, цереброспинальной жидкости, пота, мочи и. В один шаг, в растворе, нanoparticles выполнить быстрое (в течение минут) улавливание и концентрации с низкой молекулярной массой аналиты ^{10, 11, 13, 15-18.} Белки затем элюируют из наночастиц, и обнаружить с помощью Вестерн-блоттинга ^19-21, масс-спектрометрии ^{10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23,} иммунологические / ELISA, ^{10, 11, 15, 18,} ​​или с обращенной фазой белок микрочипов ^{16, 24} анализы. Наночастицы функционализирован химической приманки, и представления основной или архитектуру ядра оболочки, захват и сосредоточиться белки, основанные на свойствах физико приманки / оболочка. Поэтому различные красители, использовавшиеся для наночастиц будет фиксировать различные подмножества белков с различной эффективностью на основе близости красителя, рН раствора, и наличие / отсутствие конкурирующих высокие-изобилии белки ^13. Кроме того, количество наночастиц по отношению к объему раствора влияет на выход белка из наночастиц. Эти аспектыГидрогель заготовки наночастиц продемонстрированы с использованием трех различных приманок наночастиц для уборки белков из образцов плазмы, которые содержат большое количество белка, и от образцов мочи, которые обычно не содержат большое количество белка. В этом протоколе мы продемонстрировать сбор и концентрации фактора некроза опухолей альфа (ФНО) из образцов плазмы с использованием поли (NIPAm-CO-AAC), поли (NIPAm / краситель), и наночастицы core- оболочки (поли (NIPAm-CO-VSA)) . Поли (NIPAm / краситель) наночастицы показано сосредоточиться Mycobacterium видовой антиген, который был добавлен в образцах мочи человека, чтобы имитировать микобактерий туберкулеза инфицированных людей.

протокол

Плазма человека и мочу собирали здоровых доноров-добровольцев, с письменного информированного согласия, следующие Университет Джорджа Мейсона Экспертный совет утвердил протоколы. Доноры были поровну распределены между кавказскими мужчинами и женщинами в возрасте от 25 и 42-образцы были проанализированы по отдельности, а не были объединены.

1 наночастиц Обработка сыворотки или плазмы

Потенциальные низкие обильные биомаркеров в плазме захвачены, в растворе, с наночастицами гидрогеля. Частицы добавляют к плазме, инкубируют, отделяют центрифугированием, промывают и захваченного белки элюируют. Элюированные белки сушили в потоке азота на выходе масс-спектрометрии и идентификации последовательности.

1. Развести 500 мкл сыворотки 1: 2 50 мМ Трис HCl рН 7 (500 мкл сыворотки + 500 мкл TrisHCl) в микроцентрифужных трубки.
2. Добавить 500 мкл поли (NIPAm / AAC) основной nanopстатьи. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. Спин образца при 16100 х г, 25 ° С в течение 10 мин в центрифуге, снабженной фиксированным углом ротора. Снимите и выбросьте супернатант.
4. Добавить 500 мкл тиоцианат натрия (25 мм) к осадку. Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз.
5. Спин образца при 16100 х г, 25 ° C в течение 10 мин в центрифуге с ротором с фиксированным углом. Снимите и выбросьте супернатант.
6. Добавить 500 мкл воды MilliQ в наночастиц гранул. Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз.
7. Спин образца при 16100 х г, 25 ° C в течение 10 мин в центрифуге с ротором с фиксированным углом. Снимите и выбросьте супернатант.
8. Подготовка свежего буфера элюции: Добавить 700 мкл ацетонитрила до 300 мкл гидроксида аммония в чистую пробирку. Внимание: гидроксид аммония вызывает коррозию. Используйте с соответствующим вентиляции. Примечание: Буфер для элюирования должны быть подготовительныеAred непосредственно перед использованием. Не храните буфер элюирования.
9. Добавить 300 мкл буфера для элюции с наночастицами гранул. Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
10. Спин образца при 16100 х г, 25 ° C в течение 10 мин в центрифуге с ротором с фиксированным углом. Снимите и сохраните элюата в чистом, с надписью микроцентрифужных трубки.
11. Повторите шаги 1,9 - 1,10. Объедините две элюаты в одну пробирку микроцентрифуги.
12. Сушат элюата в токе азота в азот испарителя коллектора на 42,1 ° С, с потоком воздуха, установленным в 8 (рис 2F).
13. Храните сушеные элюата при комнатной температуре в течение O / N хранения, или при -20 ° С в течение длительного хранения, до масс-спектрометрии, вестерн-блоттинга, или ИФА (по желанию).

2 наночастиц Обработка проб мочи

Нормальная моча содержит менее 30 мг / дл и белокменьше 1 + крови. Тем не менее, многие болезни / условия могут изменить нормальные уровни белка в моче и крови. Для помощи в определении оптимального объема наночастиц для добавления в образце мочи, анализ мочи выполняется до наночастиц уборки. Моча биомаркеры могут существовать в чрезвычайно низких концентрациях, что может потребовать оптимизации соотношение количества наночастиц в объеме мочи. Эта процедура описывает наночастиц сбор образцов мочи для последующего Вестерн-блоттинга.

1. Сбор образцов мочи в чистую, сухую пластиковую чашку. 22 мл Минимальный объем требуется. Магазин мочи не образцы при -80 ° С до готовности проанализировать.
2. Разморозить замороженные мочи при комнатной температуре или при температуре 4 ° CO / N. Кратко Смешайте на вортексе. Налейте по крайней мере, 22 мл мочи в 50 мл коническую полипропиленовую пробирку нижней.
3. Спин мочу в центрифуге с поворотно-откидной ротор в 3700 мкг в течение 15 мин. Слейте мочу, не нарушая гранул, в чистую 50 мл коническим днищем polypropylene трубки. Откажитесь от осадка.
4. Выполните анализ мочи с помощью мульти-аналита "анализ мочи" Реагент полосу с. Примечание: хранить индикаторных полосок в плотно закрытом контейнере, вдали от прямых солнечных лучей и влаги ^{17, 18.}
   1. Положите реагент полосы, лицевой стороной вверх, на чистой, сухой бумажной салфеткой.
   2. С помощью одноразового пипетки для аспирации 1 мл мочи, полученного на стадии 2.3.
   3. Установите таймер на 2 мин, но не запускайте его. Быстро обойтись 1 - 2 капли мочи на каждой тестовой площадки полосы реагента. Сразу запустить таймер. Примечание: Не погружайте полоску реагента непосредственно в контейнере мочи. Краситель / химические показатели в полосе реагента может потенциально вымываться из полосы с реагентом в контейнер мочи.
   4. В то время, указанному на упаковке реагента полосы, записывать качественные результаты для различных аналитов на полосе реагента путем сравнения цвета отдельных полос реагентов с соответствующим цветовым кодированием Индикаров на контейнер реагента. Типичные нормальные результаты мочи: (нормальный или отрицательный) для крови, белка, лейкоцитов, нитрита, глюкозы и кетонов, билирубина, и уробилиногена; РН мочи (5,5 - 7,0); удельный вес (1,001 - 1,020). Примечание: Высокие уровни белка в образце мочи может конкурировать с представляющим интерес белком за сайты связывания на наночастицах. Чтобы максимизировать сбор белка с наночастицами, объем наночастиц / соотношение объем мочи может быть настроен на любой предельной конкуренции со стороны высоких белков численности или могут быть оптимизированы для сбора белки, которые существуют в очень низких концентрациях. Если значение белка в моче является 1+ или больше, добавить 2x объемы наночастиц в шаге 2.5 ниже. Если интерес аналита является очень низким распространенный белок, может быть необходимо увеличить объем наночастиц до 2 мл (фигура 3).
5. Передача 20 мл осветленной мочи, полученного на стадии 2.3 в чистую 50 мл коническую полипропиленовую пробирку нижней. Ненарушить любой мусор / осадок, который может быть в нижней части трубки мочи. Добавить 200 мкл наночастиц в образце 20 мл мочи. Кратко Смешайте на вортексе. Примечание: Если значение белка в моче является 1 + или выше, добавляют 400 мкл наночастиц в 20 мл мочи.
6. Инкубируйте мочи / наночастиц смесь в течение 30 мин при комнатной температуре, без раскачивания / перемешивания.
7. Крутить мочи / суспензии наночастиц в центрифуге, снабженной колебательного ротора на 3700 мкг в течение 10 мин. Примечание: Если гранулы не видно После центрифугирования вращаться образцы в течение дополнительных 2 - 7 мин.
8. Снимите и выбросьте супернатант. Добавить 500 мкл MilliQ воды в осадке наночастиц.
9. Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз. Перенесите раствор наночастиц в чистую 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
10. Спин наночастиц в центрифуге, снабженной фиксированным углом ротора при 16100 х г в течение 10 мин. Примечание: Если осадок не видно Фольмычание центрифугирования, спина образцы для дополнительного 2 - 7 мин.
11. Снимите и выбросьте супернатант.
12. Повторите шаги 2.8 и 2.11 (в два раза) с 200 мкл 18 MilliQ воды, чтобы вымыть наночастиц.
13. Подготовка свежего буфера элюции: Добавить 970 мкл ацетонитрила до 30 мкл гидроксида аммония в чистую пробирку. Внимание: гидроксид аммония вызывает коррозию. Используйте с соответствующим вентиляции. Примечание: элюирующий буфер должен быть подготовлен непосредственно перед использованием. Не храните буфер элюирования.
14. Добавить 20 мкл буфера для элюции с наночастицами гранул. Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
15. Вращайте образцы наночастиц на 16100 мкг в течение 10 мин. Снимите и сохраните супернатант в чистую, 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Не нарушить наночастиц осадок. Откажитесь от осадка в биологической мусор.
16. Поместите образцы в стойку в химическом вытяжном шкафу. Откройте крышки и вклUbate при комнатной температуре в течение 30 мин. С другой стороны, не размещать образцы в токе азота при 40 ° С до сухого (1 - 2 часа).
17. Добавить 15 мкл Трис-глицин SDS буфера для образцов (2x) к образцам. Тепло в 100 не ° С в сухом тепла блока в течение 5 мин с открытыми крышками или пока объем левой в трубке не более 20 мкл. Примечание: не используйте кипящей водяной бане. Влажность из водяной бани предотвращает испарение буфера.
18. Поместите крышку на трубах. Удалить труб из теплового блока. Образец можно хранить при -80 ° С или использовать непосредственно для последующего Вестерн-блот-анализа.

Результаты

Гидрогель наночастиц Размер и Единообразие

Поли (NIPAm-AAC) частицы были произведены с чрезвычайно высоким выходом и воспроизводимости между странами и внутри партий. Частицы имеют очень хорошую коллоидную стабильность при комнатной температуре в течение времен?...

Обсуждение

Клиническое значение

Сыворотки или плазмы, как полагают, содержат низким изобилие циркулирующей белки и пептиды, которые могут обеспечить богатый источник информации о состоянии организма в целом. Несмотря на обещание сыворотки протеомики, существуют три осн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
hydrogel nanoparticles	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water			Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50mM pH7.0	VWR	IC816116	50mM, pH 7
Acetonitrile	BDH	BDH1103-4LP	available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH	BDH	BDH3014	available from VWR, assayed at 28-30% NH3
sodium thiocyanate 25mM	Acros Organics	419675000	for serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips	Siemens	2161	for urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	use at room temperature to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block	Barnstead	11-715-125DQ	do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold	Organomation Associates	Microvap118	for serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor	Sorvall	Legend series	50ml tube capacity, rcf 3700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor	Eppendorf	5424	1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22	with screw caps for urine samples
1.5ml microcentrifuge tubes	Eppendorf	22363204
Disposable plastic transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	at least 1ml capacity
Vortex mixer	Fisher Scientific	50-949-755
Timer	Fisher Scientific	S04782	seconds/minutes