Hydrogel nanoparticules récolte de plasma ou l'urine pour la détection des protéines de faible abondance

Résumé

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Résumé

La découverte de biomarqueurs roman joue un rôle crucial dans la fourniture de la détection de la maladie plus sensible et spécifique. Malheureusement, de nombreux biomarqueurs faible abondance qui existent dans les fluides biologiques ne peuvent pas être facilement détectés par spectrométrie ou immuno-essais, car ils sont présents en très faible concentration, sont labiles, et sont souvent masqués par des protéines de haute abondance comme l'albumine ou immunoglobulines masse. Appât contenant du poly (N-isopropylacrylamide) (NiPAM) des nanoparticules à base sont en mesure de surmonter ces barrières physiologiques. En une seule étape, ils sont capables de capturer, de se concentrer et de préserver les biomarqueurs de fluides corporels. Analytes de faible masse moléculaire pénètrent dans le noyau de la nanoparticule et sont capturés par différents colorants chimiques organiques, qui agissent comme des appâts de haute affinité de la protéine. Les nanoparticules sont capables de concentrer les protéines d'intérêt par plusieurs ordres de grandeur. Ce facteur de concentration est suffisante pour augmenter le niveau de protéine de telle sorte que les protéines sont dans l'la limite de détection de courant de spectromètres de masse, un transfert de Western, et les dosages immunologiques. Les nanoparticules peuvent être incubées avec une grande variété de fluides biologiques et qu'ils sont capables d'enrichir considérablement la concentration de protéines et de peptides de faible poids moléculaire tout en excluant l'albumine et d'autres protéines de haut poids moléculaire. Nos données montrent que 10 000 fois l'amplification de la concentration d'un analyte particulier peut être réalisé, ce qui permet la spectrométrie de masse et des analyses immunologiques pour détecter les marqueurs précédemment indétectables.

Introduction

Malgré l'achèvement du séquençage du génome humain, des progrès significatifs ont pas été réalisés dans l'identification des biomarqueurs prédictifs de la maladie à un stade précoce, ou qui en corrélation avec le résultat thérapeutique, ou le pronostic ^1. Une des raisons de cette absence de progrès est que de nombreux biomarqueurs potentiellement importantes existent à une concentration inférieure à la limite de détection de la spectrométrie de masse conventionnelle et d'autres plates-formes de découverte de biomarqueurs. La spectrométrie de masse (MS) et la sclérose en surveillance de réaction (MRM) ont une sensibilité de détection typiquement supérieure à 50 ng / ml alors que la majorité des analytes mesurés par des dosages immunologiques à une chute en laboratoire clinique dans la plage comprise entre 50 pg / ml et 10 ng / ml . Cela signifie que de nombreux biomarqueurs, en particulier dans les premiers stades d'une maladie ne peuvent pas être détectés par MS conventionnelle et MRM ^2. En outre, la présence de protéines de grande abondance telles que l'albumine et les immunoglobulines dans des fluides biologiques complexes masquent souvent par milliard de fois excess faible abondance, des protéines de faible poids moléculaire et les peptides ^{3, 4.} Pour cette raison, plusieurs étapes de préparation d'échantillon sont nécessaires avant le séquençage par spectrométrie de masse et identification. Une telle étape préparatoire emploie l'épuisement des protéines de haute abondance de commerce colonnes d'épuisement ^5-8. Malheureusement, cette étape conduit à la réduction du rendement des biomarqueurs candidats car elles sont souvent associées de manière non covalente avec des protéines de transport qui sont éliminés. Une autre difficulté est représenté par la stabilité de biomarqueurs candidats ex-vivo une fois que les échantillons sont prélevés. Les protéines sont soumises à une dégradation par des protéases endogènes ou exogènes ^9. Des nanoparticules d'hydrogel peuvent dépasser ces problèmes critiques en amplifiant la concentration des biomarqueurs putatif à un niveau dans l'intervalle de l'essai, tout en protégeant de la dégradation de la protéine ^{de 10 à 13.}

Il est important de noter èmeprotéines à bas poids moléculaire dans le sang sont un mélange de petites protéines intactes ainsi que des fragments de protéines de grande taille. les protéines dérivées du tissu de plus de 60 kDa sont trop grands pour entrer passivement le flux sanguin à travers la membrane basale vasculaire, mais ils peuvent être représentés dans le sang en tant que peptides ou fragments de protéines ^14. Notre objectif est de mesurer de nouveaux biomarqueurs circulants qui peuvent être candidats pour la détection précoce de la maladie, la stratification des patients pour le traitement et le suivi de la réponse au traitement. Les nanoparticules sont créés afin d'exclure de manière sélective des immunoglobulines haut de l'abondance de l'albumine et, en même temps, tout en capturant les petites protéines et les peptides et les concentrer jusqu'à 100 fois en fonction du volume de départ.

Notre groupe a identifié un ensemble de petits colorants organiques qui peuvent agir avec succès comme appâts moléculaire élevé d'affinité pour les protéines et les peptides. Liaison protéine-colorant est vraisemblablement due à une combinaison d'interactions hydrophobes et électrostatiquess. Les noyaux aromatiques sur le colorant s'intercalent avec des protéines par l'intermédiaire des poches hydrophobes sur la surface de la protéine ^11.

Les appâts, en fonction de leur composition chimique, présentent une affinité particulière pour les classes d'analytes sélectionnés. Les appâts sont en concurrence avec les protéines de transport, telles que l'albumine, des protéines ou des peptides. Les protéines / peptides de poids moléculaire bas deviennent piégés dans la particule. Les protéines de haut poids moléculaire telles que l'albumine et les immunoglobulines sont empêchés de pénétrer dans la particule en raison de la capacité de tamisage du fait de la porosité restrictive de l'hydrogel ¹¹ (figure 1).

Hydrogel nanoparticules sont synthétisées par polymérisation par précipitation initiée par le persulfate d'ammonium ^11. AMsopropylacrylamide (NiPAM), co-monomères d'acide acrylique (AAC) et allylamine (AA) et l'agent de réticulation N, N'-méthylène-(BRI) sont mis à réagir à 70 ° C pendant 6 heures dans des conditions diluées ¹1, 13. L'affinité de liaison élevée en protéines de poly (N-isopropylacrylamide-co-acide acrylique) (poly (NIPAM-co-AAC) nanoparticlesis obtenue en incorporant de manière covalente des colorants contenant des groupes amino (par exemple., Les colorants sulfonatedanthraquinonetriazine) dans les nanoparticules par l'intermédiaire une réaction d'amidation réalisée dans des solvants aqueux ou organiques, selon les caractéristiques hydrophiles / hydrophobes des colorants ^{11, 13.} substitution nucléophile des groupes amine dans la nanoparticule avec l'atome de chlorure d'un colorant anthraquinonetriazine est utilisé pour créer poly contenant un colorant (NIPAM -CO-allylamine) (AA) des nanoparticules ^{11, 12.} Procédé de polymérisation en deux étapes est utilisée pour créer des nanoparticules d'hydrogel contenant une coque extérieure de l'acide vinylsulfonique (VSA) ^{11, 13.}

Des nanoparticules d'hydrogel peuvent être appliqués à divers fluides biologiques, notamment le sang total, le plasma, le sérum, le liquide céphalo-rachidien, de la sueur et l'urine. En une seule étape, en solution, le nanoparticles effectuer un rapide (quelques minutes), la séquestration et la concentration de bas poids moléculaire analytes ^{10, 11, 13, 15-18.} Les protéines sont ensuite éluées à partir de nanoparticules et détectés en utilisant un transfert de Western ^{19 à 21,} la spectrométrie de ^{10, 11, 13, 15, 18, ​​22 masse, 23,} des analyses immunologiques / ELISA ^{10, 11, 15, 18,} ​​ou protéine en phase inverse ^{16 microréseaux, 24} dosages. Les nanoparticules fonctionnalisées avec des appâts chimique, et présentant un noyau ou noyau architecture de coquille, la capture et concentrer les protéines en fonction des propriétés physico-chimiques de l'appât / enveloppe. Différents colorants incorporés dans les nanoparticules seront donc capturer différents sous-ensembles de protéines avec efficacité sur la base de l'affinité tinctoriale, le pH de la solution, et la présence / absence de protéines hautement abondante ¹³ concurrentes variable. En outre, la quantité de nanoparticules par rapport au volume de la solution aura une incidence sur le rendement de la protéine à partir des nanoparticules. Ces aspects de l'Nanoparticule hydrogel récolte sont illustrés à l'aide de nanoparticules trois appâts pour des protéines différentes de récolte à partir d'échantillons de plasma qui contiennent des quantités élevées de protéines, et à partir d'échantillons d'urine, qui ne contiennent généralement pas de grandes quantités de protéine. Dans ce protocole, nous démontrons la récolte et la concentration de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) à partir des échantillons de plasma en utilisant le poly (NIPAM-co-AAC), le poly (NIPAM / colorant), et des nanoparticules d'enveloppe core-(poly (NIPAM-co-VSA)) . Le poly (NIPAM / colorant) des nanoparticules sont présentés à concentrer l'antigène de Mycobacterium espèce qui a été ajouté à des échantillons d'urine humaine, pour imiter Mycobacterium tuberculosis individus infectés.

Protocole

Le plasma humain et l'urine a été prélevé sur des donneurs volontaires sains, avec le consentement éclairé écrit, à la suite Institutional Review Board de l'Université George Mason protocoles approuvé. Les bailleurs de fonds ont été répartis de manière égale entre les hommes et les femmes de race blanche âgés de 25 et 42 échantillons ont été analysés individuellement et n'ont pas été regroupées.

1. nanoparticules traitement de sérum ou de plasma échantillons

Faible abondance de marqueurs biologiques potentiels dans le plasma sont capturés, en solution, avec des nanoparticules d'hydrogel. Les particules sont ajoutées au plasma, incubé, séparé par centrifugation, lavées, et les protéines capturées sont éluées. Les protéines éluées sont séchés sous un courant d'azote pour le séquençage par spectrométrie de masse et en aval identification.

1. Diluer 500 ul de sérum de 1: 2 avec du Tris-HCl 50 mM pH 7 (500 ul de sérum de 500 ul de Tris-HCl +) dans un microtube de centrifugation.
2. Ajouter 500 ul de poly (NiPAM / AAC) noyau nanoparticles. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
3. Tourner l'échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse équipée d'un rotor à angle fixe. Retirer et jeter le surnageant.
4. Ajouter 500 ul de thiocyanate de sodium (25 mM) à la pastille. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois.
5. Tourner l'échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe. Retirer et jeter le surnageant.
6. Ajouter 500 ul d'eau MilliQ à la pastille de nanoparticules. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois.
7. Tourner l'échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe. Retirer et jeter le surnageant.
8. Préparer le tampon d'élution frais: ajouter 700 ul d'acétonitrile à 300 ul d'hydroxyde d'ammonium dans un tube propre. Attention: l'hydroxyde d'ammonium est corrosif. Utiliser avec une ventilation appropriée. Remarque: Le tampon d'élution doit être préparationared immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker le tampon d'élution.
9. Ajouter 300 ul de tampon d'élution à la pastille de nanoparticules. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
10. Tourner l'échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe. Retirer et mettre de l'éluat dans un tube à centrifuger propre, étiqueté.
11. Répétez les étapes 1.9 à 1.10. Combinez les deux éluats dans un tube à centrifuger.
12. Sécher les éluats sous flux d'azote dans un collecteur d'évaporateur d'azote à 42,1 ° C, avec un débit d'air fixé à 8 (Figure 2F).
13. Stocker l'éluat séché à température ambiante pendant O / N stockage, ou à -20 ° C pour le stockage à long terme, avant la spectrométrie de masse, western blot ou dosages ELISA (en option).

2 Traitement des nanoparticules des échantillons d'urine

L'urine normale contient moins de 30 mg / dl de protéine etmoins de 1 + sang. Cependant, de nombreuses maladies / conditions peuvent modifier les niveaux normaux de protéines dans l'urine et le sang. Pour aider à déterminer le volume optimal de nanoparticules à ajouter à l'échantillon d'urine, une analyse d'urine est réalisée avant la récolte nanoparticule. biomarqueurs d'urine peuvent exister dans des concentrations extrêmement faibles, ce qui peut nécessiter l'optimisation du ratio de nanoparticules au volume d'urine. Cette procédure décrit nanoparticule récolte des échantillons d'urine pour analyse western blot en aval.

1. Prélever des échantillons d'urine dans un endroit propre, sec gobelet en plastique. A 22 ml de volume minimum est nécessaire. urine de conserver les échantillons à -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse.
2. Décongeler l'urine congelés à température ambiante ou à 4 ° CO / N. Mélanger brièvement sur un vortex. Verser au moins 22 ml d'urine dans un fond conique tube en polypropylene de 50 ml.
3. Produit dérivé de l'urine dans une centrifugeuse à rotor pivotant à 3700 xg pendant 15 min. Décanter l'urine, sans perturber le culot, dans un polypr fond conique de 50 ml propreTube opylene. Éliminer le culot.
4. Effectuer l'analyse d'urine en utilisant un multi-analyte "urine jauge" bandelette réactive. Remarque: stocker les bandelettes réactives dans un récipient hermétiquement fermé à l'abri des rayons du soleil et de l'humidité ^{17, 18} direct.
   1. Posez la bande de réactif, face vers le haut, sur une serviette en papier sec.
   2. Utiliser une pipette jetable de 1 ml d'aspirer l'urine préparé à l'étape 2.3.
   3. Réglez une minuterie pendant 2 min, mais ne commencez pas. Passer rapidement 1 - 2 gouttes d'urine sur chaque plot de test de la bandelette réactive. Commencer immédiatement la minuterie. Note: Ne pas plonger la bandelette réactive directement dans le récipient d'urine. Les indicateurs de colorant / chimiques de la bandelette réactive peuvent potentiellement s'écouler de la bandelette réactive dans le réservoir d'urine.
   4. À l'heure indiquée sur le contenant de bandelettes réactives, enregistrer les résultats qualitatifs pour les différents analytes sur la bandelette réactive en comparant la couleur des bandelettes réactives individuelles à l'indica code couleur correspondantteurs sur le conteneur de réactif. Les résultats d'urine normales typiques sont: (normal ou négatif) pour le sang, les protéines, les leucocytes, nitrite, glucose, cétone, la bilirubine, et urobilinogen; PH de l'urine (5,5 à 7,0); densité (1,001 à 1,020). Remarque: Les niveaux élevés de protéines dans un échantillon d'urine peuvent rivaliser avec la protéine d'intérêt pour les sites sur les nanoparticules de liaison. Afin de maximiser la récolte des protéines avec des nanoparticules, l'/ volume volume d'urine nanoparticule peut être ajustée soit à concurrence de fin de course à partir de protéines de grande abondance, ou peut être optimisé pour la récolte des protéines qui existent dans de très faibles concentrations. Si la valeur de la protéine de l'urine est 1 + ou plus, ajouter des volumes 2x de nanoparticules dans l'étape 2.5 ci-dessous. Si l'analyte d'intérêt est une protéine très abondante faible, il peut être nécessaire d'augmenter le volume de nanoparticules jusqu'à 2 ml (figure 3).
5. Transférer 20 ml de l'urine clarifiée provenant de l'étape 2.3 dans 50 ml d'un fond conique propre tube en polypropylène. Needs a contextperturber les débris / granulés qui peuvent être dans le fond du tube d'urine. Ajouter 200 ul de nanoparticules à la 20 ml d'échantillon d'urine. Mélanger brièvement sur un vortex. Remarque: si la valeur de la protéine de l'urine est 1 + ou plus, ajouter 400 pl de nanoparticules de 20 ml d'urine.
6. Incuber le mélange urine / nanoparticule pendant 30 min à température ambiante, sans balancement / mélange.
7. Faites tourner la suspension urine / nanoparticules dans une centrifugeuse équipée d'un rotor swing-out à 3700 g pendant 10 min. Remarque: Si un plomb n'est pas visible de centrifugation suivant, tourner les échantillons pour un supplément de 2 - 7 min.
8. Retirer et jeter le surnageant. Ajouter l'eau de 500 pi au culot de nanoparticules.
9. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. Transférer la solution de nanoparticules à un 1,5 ml microtube propre.
10. Tourner les nanoparticules dans une centrifugeuse équipée d'un rotor à angle fixe à 16 100 xg pendant 10 min. Remarque: Si un plomb n'est pas fol visibleLowing centrifugation, tourner les échantillons pour un supplément de 2 - 7 min.
11. Retirer et jeter le surnageant.
12. Répétez les étapes 2,8 et 2,11 (deux fois) avec 200 ul 18 MilliQ eau pour se laver les nanoparticules.
13. Préparer tampon d'élution frais: Ajouter 970 ul d'acétonitrile à 30 l'hydroxyde d'ammonium ul dans un tube propre. Attention: l'hydroxyde d'ammonium est corrosif. Utiliser avec une ventilation appropriée. Remarque: Le tampon d'élution doit être préparée immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker le tampon d'élution.
14. Ajouter du tampon d'élution de 20 ul de la pastille de nanoparticules. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
15. Faites tourner les échantillons de nanoparticules à 16 100 g pendant 10 min. Retirer et conserver le surnageant dans un, 1,5 ml microtube propre. Ne pas perturber le culot de nanoparticules. Jeter le culot dans la poubelle de risque biologique.
16. Placer les échantillons dans un rack dans une hotte chimique. Ouvrir les bouchons et augmenterUbate à température ambiante pendant 30 min. Sinon, placez les échantillons sous flux d'azote à 40 ° C jusqu'à ce que sec (1 - 2 heures).
17. Ajouter 15 ul de Tris-glycine SDS tampon d'échantillon (2x) pour les échantillons. Chauffer à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 5 minutes avec les couvercles ouverts ou jusqu'à ce que le volume laissé dans le tube n'est pas supérieure à 20 pl. Remarque: ne pas utiliser un bain d'eau bouillante. L'humidité du bain d'eau permet d'éviter l'évaporation du tampon.
18. Placez le capuchon sur les tubes. Retirer les tubes du bloc de chauffage. L'échantillon peut être conservé à -80 ° C ou utilisé immédiatement pour l'analyse western blot en aval.

Résultats

Hydrogel nanoparticules Taille et uniformité

Particules de poly (NiPAM-AAC) ont été produits à très haut rendement et la reproductibilité entre et au sein des lots. Les particules ont une très bonne stabilité colloïdale à température ambiante pendant le temps nécessaire à la capture, le stockage, et l'élution des protéines (au moins 48 heures), et la précipitation de nanoparticules n'a pas été observée (figure 1) ^11. La ...

Discussion

Pertinence clinique

Un échantillon de sérum ou de plasma est censé contenir faible abondance des protéines et des peptides qui peuvent fournir une riche source d'information sur l'état de l'organisme dans son ensemble en circulation. Malgré la promesse de la protéomique sérique, il ya trois barrières physiologiques fondamentales et graves déjouant la découverte de biomarqueurs et de la traduction de bénéfice clinique ^{10, 11, 16, 25.}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
hydrogel nanoparticles	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water			Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50mM pH7.0	VWR	IC816116	50mM, pH 7
Acetonitrile	BDH	BDH1103-4LP	available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH	BDH	BDH3014	available from VWR, assayed at 28-30% NH3
sodium thiocyanate 25mM	Acros Organics	419675000	for serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips	Siemens	2161	for urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	use at room temperature to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block	Barnstead	11-715-125DQ	do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold	Organomation Associates	Microvap118	for serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor	Sorvall	Legend series	50ml tube capacity, rcf 3700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor	Eppendorf	5424	1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22	with screw caps for urine samples
1.5ml microcentrifuge tubes	Eppendorf	22363204
Disposable plastic transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	at least 1ml capacity
Vortex mixer	Fisher Scientific	50-949-755
Timer	Fisher Scientific	S04782	seconds/minutes