낮은 풍부 단백질을 검출하기위한 플라즈마 또는 소변의 하이드로 겔 나노 입자 수확

요약

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

초록

새로운 바이오 마커 발견에 더 민감하고 특정 질환 검출을 제공하는데 결정적인 역할을한다. 생물학적 유체에 존재 불행히도 많은 미량 생체 용이 질량 분석법 또는 그들이 매우 낮은 농도로 존재 불안정성이며, 종종 알부민 또는 면역 글로불린과 같은 높은 풍부한 단백질에 의해 마스킹되기 때문에 면역 분석법으로 검출 될 수 없다. 미끼 함유 폴리 (N-이소 프로필 아크릴 아미드)는 (NIPAM) 기반 나노 입자는 이러한 생리적 장벽을 극복 할 수있다. 한 단계에서 그들은 캡처 집중 체액에서 바이오 마커를 보존 할 수 있습니다. 저 분자량 분석은 나노 입자의 코어를 선택하고 높은 친 화성 단백질 베이트 행동 다른 유기 화학 염료에 의해 포착된다. 나노 입자는 몇 배에 의해 관심의 단백질을 집중 할 수 있습니다. 이 집중 계수는 단백질 내에되도록 단백질 수준을 증가시키기에 충분한현재 질량 분석기, 웨스턴 블롯 및 면역 분석법의 검출 한계. 나노 입자는 생체 체액의 과다와 함께 배양 할 수 있고, 그들은 알부민 및 기타 고 분자량 단백질을 제외하고 크게하면서 저 분자량의 단백질 및 펩티드의 농도로 농축 할 수있다. 우리의 데이타는 특정 분석 물질의 농도가 10,000 배 증폭 이전에 탐지 바이오 마커를 검출하는 질량 분석 및 면역 분석을 가능하게 달성 될 수 있음을 보여준다.

서문

인간 게놈 시퀀싱의 완성에도 불구하고 상당한 진전은 초기 질환의 예측 식별 생체 제되지 않았거나 그 치료 결과, ¹ 또는 예후와 상관 관계. 진행의 부족이 이유 중 하나는 많은 중요한 잠재적 바이오 마커는 종래의 질량 분석 등의 바이오 마커 발견 플랫폼의 검출 한계 이하의 농도로 존재한다는 것이다. 질량 분석법 (MS)과 다중 반응 모니터링 (MRM)을 전형적으로 검출 감도가 50 이상 / ㎖ 겨 동안 50 PG / ㎖ 및 10 NG / ㎖ 사이의 범위에있는 임상 화학 가을 면역 분석법에 의해 측정 된 분석 물의 대부분 . 특히 질병의 초기 단계에서 많은 바이오 마커는, 종래와 MRM MS ^(2)에 의해 검출 될 수 없다는 것을 의미한다. 또한 이러한 복잡한 생물학적 유체에서 알부민 및 글로불린 같은 고 풍부 단백질의 존재는 종종 억 배 EXC 의해 마스크ESS 미량, 저 분자량의 단백질 및 펩티드 ^{3, 4.} 따라서 여러 샘플 준비 작업 단계가 질량 분석 시퀀싱 및 식별에 앞서 요구된다. 하나는 이러한 준비 단계는 상업적으로 이용 가능한 고갈 열 ^5-8로 높은 풍부한 단백질의 고갈을 고용하고있다. 그들은 종종 비공유 제거되는 캐리어 단백질과 연관되어 있기 때문에 불행하게도이 공정은 바이오 마커 후보의 수율의 감소를 이끈다. 샘플이 수집되면 또 다른 문제는 바이오 마커 후보의 전 생체을의 안정성으로 표시됩니다. 단백질은 내인성 또는 외인성 단백질 분해 효소 ^(9)에 의해 분해 될 수 있습니다. ^10-13 열화로부터 단백질을 보호하는 동시에 하이드로 겔 나노 입자, 분석의 범위 내의 수준으로 바이오 마커 추정 농도를 증폭함으로써 이러한 중요한 과제를 초월 할 수있다.

그것은 일을 주목해야합니다LMW에서 혈액 내 단백질은 작은 그대로 단백질뿐만 아니라 큰 단백질 단편의 혼합물이다. 60 kDa의보다 큰 조직 유래 단백질은 수동적으로 혈관 기저막을 통해 혈류에 들어가기에 너무 클 수 있지만 그것들은 펩티드 또는 단백질의 단편 ^(14)과 같은 혈액에서 표현 될 수있다. 우리의 목표는 질병의 조기 진단, 치료에 대한 환자 층화하고, 치료에 대한 반응을 모니터링하기위한 후보가 될 수있는 신규 한 생체 순환을 측정하는 방법이다. 우리의 나노 입자를 동시에 작은 단백질과 펩타이드를 캡처하고 시작 볼륨에 따라 100 배에 그들을 집중하면서 선택적으로, 높은 풍부한 면역 글로불린과 알부민을 제외 만들어집니다.

우리 그룹이 성공적으로 단백질 및 펩타이드에 대해 높은 친 화성 분자 미끼 작용할 수 작은 유기 염료의 세트를 식별. 결합 단백질 염색으로 인해 소수성 및 정전 기적 상호 작용의 조합에 의한 것으로 생각된다의. 염료에 방향족 고리는 단백질의 소수성면 ^(11)에 포켓을 통해 단백질 인터리빙.

미끼는 자신의 화학에 따라 분석의 선택된 클래스에 대한 특별한 친화력을 보여줍니다. 미끼는 단백질 또는 펩티드, 알부민과 같은 담체 단백질과 경쟁. 저 분자량 단백질 / 펩타이드는 입자에 포획된다. 알부민과 글로불린과 같은 고 분자량의 단백질 때문에 하이드로 겔 ⁽¹¹⁾ (도 1)의 제한으로 인해 기공 체질 능력 입자 들어가는 것이 방지된다.

하이드로 겔 나노 입자 ⁽¹¹⁾ 황산 암모늄 침전에 의해 개시 중합에 의해 합성된다. N-이소 프로필 아크릴 아미드 (NIPAM)은 아크릴산 (AAC) 및 알릴 아민 (AA)와 가교제 N, N'-메틸렌 비스 (BIS)의 코 모노머는 희석 조건 ^(1)에서 6 시간 동안 70 ° C에서 반응하도록 허용1, 13. 폴리 높은 단백질 결합 친화도 (N-이소 프로필 아크릴 아미드 - 코 - 아크릴산) 공유 (아미노 - 함유 염료를 통합 즉., sulfonatedanthraquinonetriazine 염료)를 나노 입자로를 통해 달성 (폴리 (NIPAM-CO-AAC) nanoparticlesis 염료의 친수성 / 소수성 특성에 따라 수용성 또는 유기 용매에서 수행 아미드 화 반응은 ¹¹ anthraquinonetriazine 염료의 염소 원자를 가진 나노 입자의 아민 기의 ^13. 친 핵성 치환은 염료 - 함유 폴리 (NIPAM를 만드는 데에 이용된다 -CO-알릴 아민) ^(AA)는, 나노 입자 ^{(11) 12.} 두 단계의 중합 방법은 비닐 술폰산 (VSA) ^{(11), (13)의} 외부 쉘 나노 입자를 함유하는 하이드로 겔을 생성하는 데에 이용된다.

하이드로 겔 나노 입자는 전체 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 땀, 뇨 등의 다양한 생물학적 유체에 적용될 수있다. 한 단계에서, 용액, Nanoparticles는 (분 이내) 신속한 격리 및 저 분자량의 농도는 ^{10, 11, 13, 15-18} 수행 분석 물. 단백질이 후속하여 나노 입자로부터 용출 검출 웨스턴 분석법 ^{10, 11, 13, 15, 18, ​​22} 질량 ^{19-21 블롯, 23,} 면역 / ELISA ^{10, 11, 15, 18,} ​​또는 역상 단백질 마이크로 어레이 ^{(16), 24} 분석. 나노 입자는 화학 미끼로 작용하고, 코어 또는 코어 쉘 구조, 캡처를 제시하고 미끼 / 쉘 물리 화학적 특성에 따라 단백질을 집중한다. 나노 입자에 혼입 다른 염료 따라서 염료 선호도에 기초하여 효율, 용액의 pH, 및 고 단백질 풍부 ^(13)를 경쟁의 존재 / 부재를 가변으로 단백질의 상이한 서브 세트를 캡처한다. 또한, 용액의 부피에 관련하여 나노 입자의 양은 나노 입자에서 단백질 수율에 영향을 미칠 것이다. 이러한 측면하이드로 겔 나노 수확 단백질을 다량 함유 혈장 샘플로부터 수확하는 세 가지 단백질 나노 입자를 사용하여 입증 베이트, 전형적으로 많은 양의 단백질을 포함하지 않는 소변 샘플에서된다. 이 프로토콜에서는 수확 및 폴리 (NIPAM-CO-AAC), 폴리 (NIPAM / 염료), 및 코어 - 쉘 나노 입자를 사용하여 혈장 샘플에서 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)를 집중을 설명 (폴리 (NIPAM-CO-VSA)) . 폴리 (NIPAM / 염료) 나노 입자는 결핵균에 감염된 개인을 모방하기 위해 인간의 소변 샘플에 추가 된 마이 코박 테 리움 종의 항원을 집중 표시됩니다.

프로토콜

인간의 혈장과 소변은 조지 메이슨 대학위원회 (Institutional Review Board)가 프로토콜을 승인 한 다음, 동의서와 함께, 건강한 자원 봉사 기증자로부터 수집되었다. 기증자는 동일하게 개별적으로 분석 하였다 25, 42 샘플 세 사이의 백인 남성과 여성 사이에 분포하고 풀링되지 않았다.

혈청 또는 혈장 샘플의 1 나노 입자 처리

플라즈마의 잠재적 낮은 풍부한 바이오 마커는 하이드로 겔 나노 입자 용액에 캡처됩니다. 입자를 세척하고, 원심 분리에 의해 분리 배양 혈장에 첨가하고, 캡처 된 단백질을 용출 하였다. 용출 된 단백질을 질량 분석법 하류 서열 식별 용 질소 기류 하에서 건조시킨다.

1. microcentrifuge 관에서 50 mM의 TrisHCl pH가 7 (500 ㎕의 혈청 + 500 ㎕의 TrisHCl)와 함께 2 : 혈청 1의 500 μl를 희석.
2. 500 μL 폴리 (NIPAM / AAC) 핵심 nanop 추가기사. 실온에서 15 분 동안 품어.
3. 고정 각 로터가 장착 된 원심 분리기에서 10 분 동안 16,100 XG에 25 ° C를 샘플을 스핀. 제거하고 상층 액을 버린다.
4. 펠릿에 500 ㎕의 티오시 안산 나트륨 (25 밀리미터)를 추가합니다. 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁.
5. 고정 각도 로터와 원심 분리기에서 10 분 동안 16,100 XG에 25 ° C를 샘플을 스핀. 제거하고 상층 액을 버린다.
6. 나노 입자 펠렛을 MilliQ- 물 500 μl를 추가합니다. 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁.
7. 고정 각도 로터와 원심 분리기에서 10 분 동안 16,100 XG에 25 ° C를 샘플을 스핀. 제거하고 상층 액을 버린다.
8. 신선한 용출 버퍼를 준비 : 깨끗한 튜브에 300 ㎕의 수산화 암모늄에 μL 아세토 니트릴 700를 추가합니다. 주의 : 수산화 암모늄 부식성이다. 적절한 환기와 함께 사용합니다. 주 : 용출 버퍼가 준비이어야ared 즉시 사용하기 전에. 용출 버퍼를 보관하지 마십시오.
9. 나노 입자의 펠렛에 용출 버퍼의 300 μl를 추가합니다. 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁. 실온에서 15 분 동안 품어.
10. 고정 각도 로터와 원심 분리기에서 10 분 동안 16,100 XG에 25 ° C를 샘플을 스핀. 제거하고 깨끗하고 표시된 microcentrifuge 관에 용출액을 저장합니다.
11. 1.10 - 반복 1.9 단계를 반복합니다. 한 microcentrifuge 관에이 용출액을 결합합니다.
12. 8 (그림 2 층)로 설정 공기 흐름을, 42.1 ° C에서 질소 증발기 매니 폴드의 질소 흐름에서 용출액을 건조.
13. O / N 저장을 위해 실온에서 건조 된 용출액을 저장 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C,에서 질량 분석법, 웨스턴 블롯, 또는 ELISA 분석 (옵션) 이전에.

소변 샘플의 2 나노 입자 처리

보통 소변 미만 30 밀리그램 / DL 단백질을 포함하고1 + 혈액보다. 그러나, 많은 질병 / 조건은 소변의 단백질과 혈액의 정상 수준을 변경할 수 있습니다. 소변 샘플에 추가 된 나노 입자의 최적의 양을 결정하는데 원조하기 위해, 나노 입자는 뇨를 수확하기 전에 수행된다. 소변은 생체 소변량에 나노 입자의 비율을 최적화 필요할 수도 극도로 낮은 농도로 존재할 수있다. 이 절차는 다운 스트림 서양 얼룩 분석을위한 소변 샘플의 나노 입자 수확에 대해 설명합니다.

1. 깨끗하고 마른 플라스틱 컵에 소변 샘플을 수집합니다. 22 ㎖의 최소 볼륨이 필요합니다. 분석 할 준비가 될 때까지 보관 소변은 -80 ° C에서 표본.
2. RT 또는 4 ° CO / N에서 냉동 소변을 해동. 와류 믹서에 잠깐 섞는다. 50ml의 원뿔형 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 소변 중 적어도 22 ㎖에 붓고.
3. 15 분 동안 3,700 XG에서 스윙 아웃 로터와 원심 분리기에 소변을 봐. 깨끗한 50 ML 원뿔 바닥 polypr로, 펠렛을 방해하지 않고, 소변을 가만히 따르다opylene 관. 펠렛을 폐기하십시오.
4. 다중 분석 "소변 딥 스틱"시약 스트립을 사용하여 소변 검사를 수행합니다. 참고 : 직사광선 및 습도 ^{17, 18에서} 멀리 밀폐 된 용기에 시약 스트립을 저장합니다.
   1. 깨끗하고 마른 종이 타월에 시약 스트립, 페이스 업을 놓습니다.
   2. 단계 2.3에서 제조 소변 1 ㎖를 흡인하기 위해 일회용 피펫을 사용합니다.
   3. 2 분 타이머를 설정하지만, 그것을 시작되지 않습니다. 시약 스트립의 각각의 테스트 패드에 소변이 드랍 - 빠르게 한 분배. 즉시 타이머를 시작합니다. 참고 : 소변 용기에 직접 시약 스트립을 잠수함하지 마십시오. 시약 스트립에 염료 / 화학적 지표 잠재적 소변 용기 내로 시약 스트립의 용출 될 수있다.
   4. 시약 스트립 용기에 표시된 시간에 대응하는 컬러 코드에 바랭이 개별 시약 스트립의 색을 비교하여 시약 스트립에 대한 다양한 분석 물질의 질적 결과를 기록시약 용기에 TORS. 일반적인 정상적인 소변의 결과는 다음과 같습니다 (일반 또는 음) 혈액, 단백질, 백혈구, 아질산염, 포도당, 케톤, 빌리루빈, 그리고 urobilinogen에 대한; 소변의 pH (5.5-7.0) 비중 (1.001-1.020). 주 : 소변 표본에서 높은 수준의 단백질은 나노 입자 결합 부위에 대한 관심의 단백질과 경쟁 할 수있다. 나노 입자와 단백질을 수확을 극대화하기 위해, 나노 입자 부피 / 소변 체적비가 높은 풍부한 단백질 중 하나에서 제한 경쟁으로 조절 될 수 있거나, 매우 낮은 농도로 존재하는 단백질을 수확하기 위해 최적화 될 수있다. 요 단백 값이 1 + 이상이있는 경우, 아래 단계 2.5에서 나노 입자의 2 배 볼륨을 추가합니다. 주요 피검 물이 매우 낮음 풍부한 단백질 인 경우에는 2 ㎖ (도 3)를 나노 입자의 양을 증가시킬 필요가있을 수있다.
5. 전송 깨끗한 50 ML 원뿔 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 단계 2.3에서 정화 된 소변 20 ㎖. 하지 마십시오소변 튜브의 아래쪽에있을 수있는 어떠한 파편 / 펠렛을 방해. 20 ㎖의 소변 샘플에 나노 입자의 200 μl를 추가합니다. 와류 믹서에 잠깐 섞는다. 요 단백 값이 1 + 이상이면, 20 ㎖의 소변에 나노 입자의 400 μl를 추가합니다.
6. 락 / 혼합없이, RT에서 30 분 동안 소변 / 나노 입자 혼합물을 배양한다.
7. 10 분 동안 3,700 XG에서 스윙 아웃 로터가 장착 된 원심 분리기에 소변 / 나노 입자 현탁액을 스핀. 주 : 펠릿을 보이는 다음 원심 분리가없는 경우, 부가적인 2 샘플을 스핀 - 7 분.
8. 제거하고 상층 액을 버린다. 나노 입자의 펠릿에 500 μL을 MilliQ- 물을 추가합니다.
9. 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁. 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 나노 입자 용액을 전송합니다.
10. 10 분 동안 16,100 XG에 고정 된 앵글 로터를 구비 한 원심 분리기에서 스핀 나노 입자. 주 : 펠릿 FOL 표시가 없으면7 분 - 원심 분리를 lowing의, 추가로 2 샘플을 회전.
11. 제거하고 상층 액을 버린다.
12. 반복 나노 입자를 씻어 200 μl의 18을 MilliQ- 물 (2 회) 2.8 및 2.11 단계를 반복합니다.
13. 신선한 용출 버퍼를 준비 : 깨끗한 튜브에 30 ㎕의 수산화 암모늄에 μL 아세토 니트릴 970를 추가합니다. 주의 : 수산화 암모늄 부식성이다. 적절한 환기와 함께 사용합니다. 참고 : 용출 버퍼가 즉시 사용하기 전에 미리 준비되어 있어야합니다. 용출 버퍼를 보관하지 마십시오.
14. 나노 입자의 펠렛에 20 μL 용출 버퍼를 추가합니다. 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁. 실온에서 15 분 동안 품어.
15. 10 분 동안 16,100 XG에서 나노 입자 샘플을 스핀. 제거하고 깨끗하고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 저장합니다. 나노 입자 펠렛을 방해하지 마십시오. 생물 학적 쓰레기 펠렛을 폐기하십시오.
16. 화학 흄 후드에서 랙에 샘플을 놓습니다. 뚜껑을 열고 inc를30 분 동안 RT에서 ubate. (- 2 시간 1) 또는 건조 할 때까지 40 ° C에서 질소 흐름에서 샘플을 배치.
17. 샘플 15 ㎕의 트리스 - 글리신 SDS 샘플 버퍼 (2 배)를 추가합니다. (100)에서 열 열거 나 튜브에 남아있는 볼륨까지 모자와 5 분 동안 건조 열 블록 ° C는 더 이상 20 μL 없습니다. 참고 : 끓는 물에 목욕을 사용하지 마십시오. 수욕에서 습도는 버퍼의 증발을 방지한다.
18. 튜브에 뚜껑을 놓습니다. 열 블록에서 튜브를 제거합니다. 샘플은 -80 ° C에서 저장 또는 다운 스트림 서양 얼룩 분석을 위해 즉시 사용할 수 있습니다.

결과

하이드로 겔 나노 입자 크기와 균일

폴리 (NIPAM-AAC) 입자 사이의 일괄 처리 내에서 매우 높은 수율과 재현성으로 제작되었다. 입자는 캡처, 저장, 및 단백질의 용출 (적어도 48 시간)에 필요한 시간 동안 RT에서 매우 좋은 콜로이드 안정성을 가지고 있고, 나노 입자가 석출 (도 1) ^(11)이 관찰되지 않았다. 콜로이드 안정성은 나노 입자에 의한 신속...

토론

임상 관련성

혈청 또는 혈장 시료 전체적으로 유기체의 상태에 관한 정보의 다양한 소스를 제공 할 수있는 단백질 및 펩티드를 순환 미량을 포함하는 것으로 생각된다. 혈청 단백질 체학의 약속에도 불구하고, 임상 적 이익을 ^{10, 11, 16, 25로} 바이오 마커의 발견과 번역을 훼방 세 가지 기본 심각한 생리적 장벽이있다.

1 중요한 진단 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
hydrogel nanoparticles	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water			Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50mM pH7.0	VWR	IC816116	50mM, pH 7
Acetonitrile	BDH	BDH1103-4LP	available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH	BDH	BDH3014	available from VWR, assayed at 28-30% NH3
sodium thiocyanate 25mM	Acros Organics	419675000	for serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips	Siemens	2161	for urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	use at room temperature to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block	Barnstead	11-715-125DQ	do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold	Organomation Associates	Microvap118	for serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor	Sorvall	Legend series	50ml tube capacity, rcf 3700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor	Eppendorf	5424	1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22	with screw caps for urine samples
1.5ml microcentrifuge tubes	Eppendorf	22363204
Disposable plastic transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	at least 1ml capacity
Vortex mixer	Fisher Scientific	50-949-755
Timer	Fisher Scientific	S04782	seconds/minutes