为快速细菌鉴定和药敏试验的准备血培养微丸

摘要

从血培养阳性的快速细菌沉淀制备可以用作用于诸如鉴定通过MALDI-TOF，革兰氏染色，药敏试验和基于PCR的试验样品。结果能够迅速地传达给临床医生来改善患者的血液感染的痛苦的结果。

摘要

血流感染和败血症的发病率和死亡率的主要原因。患者从菌血症患的成功结果依赖于快速鉴定病原体的指导最佳抗生素治疗。从血培养阳性的革兰氏染色的分析，可以迅速进行，并已显著影响抗生素的治疗方案。然而，准确地识别病原体的，仍然需要建立最优针对性的治疗。我们在座的从血培养阳性可作为样本几个基本的下游应用，如鉴定MALDI-TOF MS，药敏试验（AST）采用纸片扩散法或自动化助攻系统简单，快速的细菌沉淀的准备并且通过自动的基于PCR的诊断测试。直接作用于血培养细菌沉淀应用于这些不同的标识和AST系统的性能是非常SImilar的性能通常是从生长在琼脂平板上的菌落分离得到。相较于传统的方法，迅速收购细菌沉淀的显著减少了时间报告均标识和AST。因此，下面的血培养阳性，鉴定通过MALDI-TOF可以在少于1小时，而AST的结果通过自动AST系统或纸片扩散测定法在8至18小时，分别进行报告。类似地，快速的基于PCR的测定法的结果可被传达给临床医生不到2小时以下内容的菌血症的报告。总之，这些结果表明，血培养细菌沉淀的快速制备具有该识别和AST的周转时间，从而对患者的血液感染的患成功结果的显著影响。

引言

血液感染和败血症住院的病人发病和死亡的一个主要原因。因此，死亡率为血液感染有关的约14％被观察到的住院病人的37％，并可能增加至35％，在重症监护病房的患者^1-3。快速鉴定病原体的是枢转，以指导最佳的抗微生物治疗，并增加抗微生物疗法^4,5的成功结果。革兰氏染色，从血培养阳性的快速分析已经对抗生素治疗^6,7但准确识别病原体的法律适应化显著影响需要提供最适合的抗生素治疗的患者。举例来说，不同的抗生素治疗方案有以下菌血症与肠球菌和链球菌，很难通过革兰氏染色，以区分实施。同样的，在鉴定物种利埃尔需要检测革兰氏阴性肠杆菌编码的染色体AmpC酶基因，其赋予增加的耐β-内酰胺^8。

用血培养阳性，常规的诊断方法是传代的传染性病原体的不同琼脂平板上，这就需要采用不同方法，包括生化检查，在不同的选择性培养基上生长和全自动微生物鉴定系统几个小时的额外孵化前鉴定。时间的常规诊断方法的结果是约1至3天。

基质辅助激光解吸/飞行时间的电离质谱（MALDI-TOF）技术快速鉴定微生物的出现提供了一种新的工具，以快速识别从阳性血直接从生长在琼脂平板上的菌落微生物也培养物（ 图^1）9-12。日E使用MALDI-TOF的从血培养鉴定传染性病原体的时候结果已经显著减小到几分钟，而不是通过传统的方法所需要的时间和天数。如由Croxatto 等 ¹³所讨论的，MALDI-TOF鉴定的效率依赖于不同的参数，包括微生物的纯度和数量。这两个标准都容易从生长在琼脂平板上的菌落分离得到的，但需要对细菌浓缩和纯化从复杂样品如血液培养，其中含有多种细胞和蛋白质成分可与MALDI-TOF鉴定干扰预分析处理。

从血培养各种微生物'的分离方法中的一些研究，其中包括皂角苷或其它温和的清洁剂的方法进行细菌提取^9,14，血清分离方法¹⁰已被使用，裂解离心方法¹² 和商业解决方案，如sepsityper套件。我们的细菌学诊断实验室已经开发出了基于氯化铵红细胞裂解，允许快速识别细菌和酵母通过MALDI-TOF和自动识别系统（ 图^2）15一个简单的血液培养菌体的准备。这血培养微丸制剂也为其他直接下游应用，如革兰染色阳性的样本，自动化PCR为基础的诊断测试，如POCT-PCR的快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA）和药敏试验用自动化系统的AST和/或通过在琼脂平板上扩散测定（ 图3）。

在这项工作中，我们描述了血培养菌体的制备方法的不同步骤由Prod'hom 等人所说明^15（ 图4）。我们也将取消划线为3，可以在血培养粒料进行的主要应用的协议:用自动化系统^16，用于肠杆菌和葡萄球菌和自动化PCR-鉴定通过MALDI-TOF ^15，标识（ID）和抗生素敏感性试验（AST）基于诊断测试为MRSA ¹⁷的检测。

研究方案

该协议已开发和验证实施作为常规工具之前，下面我们机构的研发流程和道德准则。

1，制备血培养菌体通过氯化铵红细胞裂解过程

1. 制备血培养阳性随后离心。
   1. 消毒血培养上限。添加70％乙醇的瓶盖和焚烧。
      注意:不要执行在层流罩这一步。
   2. 将瓶子在层流罩。收集5毫升血培养有20G的注射器。
   3. 添加5毫升血培养中装有45毫升无菌水（H ₂ O）50毫升离心管中，混匀。
2. 制备血培养菌体裂解通过离心。
   1. 离心样品在1000×g离心在室温10分钟。
   2. 雷莫已经上清液（主要含H ₂ O和血细胞）用实验室真空泵。
   3. 重悬在1ml的自制氯化铵裂解溶液（0.15M的_氯化铵 ，1mM的KHCO _3）沉淀。分解的丸粒通过刮削并通过涡旋管和离心的样品在140×g离心在室温10分钟。
   4. 丢弃它主要含有红细胞碎片的上清液。
      1. 如果颗粒仍然出血，重悬沉淀在2ml无菌蒸馏H _{2 O}中，进一步溶解残存的红血细胞和清洗沉淀。离心样品在140×g离心在室温10分钟，并弃去上清液。
   5. 悬浮颗粒在200微升H _{2 O}的
3. 血培养物上的各种选择性和非选择性琼脂培养基上继代培养。
   1. 收取1毫升血培养有20G的注射器。
   2. 接种1滴血文化诠释o在血琼脂，巧克力琼脂，McConkey琼脂和Schaedler琼脂四个象限。
   3. 在37℃下的血琼脂和巧克力琼脂平板上，在5％CO ₂气氛中，McConkey琼脂在常压和Schaedler琼脂平板在厌氧条件。
   4. 按照对不同媒体细菌生长。
   5. 检查是否有细菌纯度。

2，鉴定通过MALDI-TOF质谱

1. 直接标识从血液沉淀。
   1. 传输1微升的血液沉淀在MALDI靶盘，让它干在42℃加热平台。
   2. 覆盖与1微升70％甲酸样品，让它干在42℃加热平台。
   3. 覆盖与1μl的MALDI基质的样品（饱和α-氰基-4 - 羟基肉桂酸在50％乙腈 - 2.5％三氟乙酸中的溶液），并让它干燥在42℃下加热平台。
   4. 继续执行MALDI-TOF质谱分析所描述的制造商MALDI-TOF MS系统。
   5. 如果鉴定成绩是在种的水平（例如，得分<2）无效，执行血液颗粒样品的蛋白提取。
2. 蛋白质提取的血培养沉淀后鉴定。
   1. 混合20微升用1ml 70％乙醇，离心的沉淀物以13,000 xg离心在RT 2分钟。
   2. 弃去上清液，加入25微升70％甲酸水溶液和25μl的100％乙腈以沉淀。涡大力悬浮颗粒。用吸头打破下来涡旋之前强硬的悬浮颗粒。
   3. 离心机以13,000 xg离心在RT 2分钟。传输1微升上清液（包含提取的蛋白质）在MALDI靶板上，让它干在42℃加热平台。请按2.1.2所述。

3，细菌IDENTIFication和药敏试验用全自动微生物系统

1. 制备细菌悬浮液进行细菌鉴定和AST与全自动微生物系统。
   1. 准备装有3毫升无菌0.45％NaCl溶液与全自动微生物系统兼容的塑料管。
   2. 加血培养粒料的足够体积的0.45％的NaCl溶液中，得到的细菌悬浮液对应于0.6的麦法兰浊度至0.8。测量用密度计机浊度。
      请注意:在血培养细菌沉淀的体积为50至200μl的变化以达到0.6的麦法兰浊度至0.8。
2. 如制造商所述接种的自动化革兰氏阳性（GP）或革兰氏阴性（GN）卡，用于识别和自动AST卡的革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性细菌的抗菌敏感性试验。
   注:辨识n中具有全科医生或GN卡，如果MALDI-TOF质谱鉴定得分值> 2不适用。通过传代培养的菌悬液于血琼脂（GP和GN）和麦康凯琼脂（GN）板检查菌悬液的纯度。

4，药敏试验采用纸片扩散分析

纸片扩散法是通过在药敏试验（EUCAST，3.0版，2013年4月，www.eucast.org）欧洲委员会称。

1. 细菌悬液的制备进行纸片扩散法药敏试验。
   1. 制备含有3毫升的无菌0.9％氯化钠溶液的玻璃试管中。
   2. 加血培养粒料的足够体积的0.9％的NaCl溶液中，得到的细菌悬浮液相当于0.5麦克法兰浊度。测量用密度计机浊度。
      请注意:在血培养物的体积细菌沉淀从50到200μl的变化以达到0.6的麦法兰浊度至0.8。
   3. 漩涡的菌悬液。
2. 细菌悬浮液上的Mueller-Hinton琼脂（MH）或的Mueller-Hinton琼脂，苛养菌琼脂（MHF）的接种（MH补充有5％去纤维蛋白马血和20毫克/升的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）。
   1. 蘸无菌棉签在细菌悬浮液，并轻轻转动棉签在玻璃管的内壁上除去过量的液体。
   2. 通过擦拭在三个方向上，或通过使用自动板旋转器均匀分布的菌液到氢/ MHF琼脂板的整个表面上。
3. 在接种后的琼脂平板的抗微生物磁盘中的应用。
   1. 在干燥接种琼脂手动板的表面上或通过使用敏感性盘的分配器应用密切的磁盘。
   2. 孵育板在适当的坦佩叉涂抹，并作为药敏试验EUCAST纸片扩散法所描述的氛围（3.0版，2013年4月，www.eucast.org）。

5，自动基于PCR的诊断测试为MRSA的检测

1. 使用微量，转移50微升血液中的文化沉淀成提供在20秒自动PCR为基础的诊断测试套件和旋涡的MRSA样本的试剂瓶。
2. 用1毫升微量，分配所述样本到盒的样品端口。将墨盒插入自动PCR反应体系和所描述​​的制造商开始试验。

结果

在由Prod'hom 等 ¹⁵进行的研究中，从78例患者由122阳性血培养的氯化铵裂解离心分离得到的细菌粒料通过MALDI-TOF MS进行分析。出了122血培养阳性，95（77.9％）被正确识别的物种水平和一（0.8％），在属的水平。其余26（21.3％）血培养颗粒没有给出可靠的鉴​​定通过MALDI-TOF。其中，21人革兰氏阳性细菌，包括13链球菌和5凝固酶阴性葡萄球菌。重要的是，10出13不明链球菌是肺炎链?...

讨论

相对于传统的血培养阳性的诊断方法，在快速采集细菌沉淀物通过使用氯化铵裂解离心方法减少时间由16至24小时的时间来报告AST由24至48小时（ 图1和报告标识3）。

迅速出台相应的抗生素治疗是关键，以提高患者的血液感染患上的结果。因此，早期识别中1小时，随后在约8至16小时，得到了迅速的AST的传染性病原体的代表在脓毒症患者的临床管理有重?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 needle gauge	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar