Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Zusammenfassung

Eine schnelle Bakterienpellet Herstellung von einer positiven Blutkultur kann als eine Probe für Anwendungen wie die Identifizierung durch MALDI-TOF, Gram-Färbung, antibiotische Resistenzprüfung und PCR-basierte Tests verwendet werden. Die Ergebnisse können schnell auf Ärzte mitgeteilt, das Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn zu verbessern.

Zusammenfassung

Blutstrominfektionen und Sepsis sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Der Erfolg von Patienten mit Bakteriämie, hängt von einer schnellen Identifizierung des Erregers zu führen optimale Behandlung mit Antibiotika. Die Analyse der Gram Flecken aus positiver Blutkultur kann schnell durchgeführt werden und bereits erhebliche Auswirkungen auf die antibiotische Therapie. Jedoch ist die genaue Identifikation des Erregers erforderlich, um die optimale gezielte Behandlung etablieren. Wir stellen Ihnen hier eine einfache und schnelle Zubereitung von Bakterienpellet einer positiven Blutkultur, die als Probe für mehrere wesentliche Downstream-Anwendungen wie Identifikation durch MALDI-TOF-MS, antibiotische Empfindlichkeitsprüfung (AST) durch Scheibendiffusionstest oder automatisierte AST-Systemen verwendet werden können und durch automatisierte PCR-basierten Diagnosetests. Die Leistung dieser direkt auf die Blutkultur Bakterienpellets angewendet unterschiedliche Identifikationssysteme und AST ist sehr similar auf die Leistung in der Regel aus isolierten Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen, die schnelle Beschaffung eines Bakterienpellet reduziert die Zeit, um sowohl Identifikation und AST zu melden. So kann nach einer Blutkultur Positivität Identifizierung durch MALDI-TOF in weniger als 1 Stunde in der Erwägung Ergebnisse AST durch automatisierte Systeme AST oder Scheibendiffusionstests innerhalb von 8 bis 18 h, jeweils angegeben werden. Ebenso können die Ergebnisse einer schnellen PCR-basierten Assays, um den Kliniker mitgeteilt weniger als 2 Stunden nach dem Bericht einer Bakteriämie. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die rasche Erstellung eines Blutkultur Bakterienpellet hat einen signifikanten Einfluss auf die Identifizierung und AST Bearbeitungszeit und damit auf das erfolgreiche Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn.

Einleitung

Bakteriämien und Sepsis bei hospitalisierten Patienten sind eine der Hauptursachen von Morbidität und Mortalität. So ist die Sterblichkeit im Zusammenhang mit Infektionen Blutbahn in etwa 14% bis 37% der stationären Patienten beobachtet und kann auf 35% auf Intensivstationen Patienten ^1-3 erhöhen. Die schnelle Identifizierung des Erregers ist entscheidend zu führen optimale antimikrobielle Behandlung und den erfolgreichen Abschluss der antimikrobiellen Therapie ^4,5 zu erhöhen. Die schnelle Analyse von Gram Flecken aus positiver Blutkultur hat bereits einen erheblichen Einfluss auf die Anpassung der antimikrobiellen Therapie ^6,7, aber eine genaue Identifizierung des Erregers erforderlich, um die am besten geeigneten Antibiotika-Behandlung für die Patienten zu schaffen. Zum Beispiel haben unterschiedliche Antibiotika-Behandlung nicht ausreichend, um folgende Bakteriämie mit Enterokokken und Streptokokken, die nur schwer durch Gram-Färbung unterscheiden, sind umgesetzt werden. Ebenso Identifikation an der Art Level ist erforderlich, um Gram-negative Enterobakterien erkennen eine chromosomale ampC Gen, das eine erhöhte Resistenz gegenüber ^8-Lactamen β kodiert.

Mit einer positiven Blutkultur ist die herkömmliche diagnostische Ansatz, um die Infektionserreger auf verschiedenen Agar-Platten, die mehrere Stunden zusätzliche Inkubation vor der Identifikation mit verschiedenen Ansätzen, einschließlich biochemische Tests, Wachstum auf verschiedenen Selektionsmedien und automatische Identifikationssysteme erfordert mikrobiellen Subkultur. Die Zeit, um Ergebnisse einer herkömmlichen diagnostischen Ansatz von etwa 1 bis 3 Tagen.

Die Entstehung der Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF)-Technologie für die schnelle Identifizierung von Mikroorganismen wurde ein neues Werkzeug schnell Mikroorganismen von Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet, sondern auch direkt von der positiven Identifizierung Blut bereitgestellt Kulturen (Abbildung 1) ^9-12. The Verwendung von MALDI-TOF, um einen infektiösen Erreger aus Blutkulturen zu identifizieren deutlich die Zeit, um Ergebnisse zu ein paar Minuten anstelle von den Stunden und Tagen nach traditionellen Verfahren erforderlich ist, reduziert. Wie von Croxatto et al. Diskutiert ¹³ stützt sich die Effizienz der MALDI-TOF-Identifizierung von verschiedenen Parametern wie Reinheit und Menge des Mikroorganismus. Diese beiden Kriterien sind leicht von diskreten Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet wurden, aber benötigt eine vorge analytischen Behandlung für bakterielle Anreicherung und Reinigung von komplexen Proben wie Blutkultur, die mehrere zelluläre und Protein-Komponenten, die mit MALDI-TOF-Identifikations stören kann enthalten.

Verschiedene Mikroorganismen Isolierungsverfahren aus Blutkulturen wurden in einer Reihe von Studien einschließlich Saponin oder andere milde Detergentien Verfahren zur Extraktion bakterieller ^9,14, Serumtrennverfahren ¹⁰ verwendet Lyse Zentrifugationsverfahren ¹² und kommerziell Lösungen wie das sepsityper-Kit. Unsere Bakteriologie Diagnoselabor hat einen einfachen Blutkultur Bakterienpellet Zubereitung auf Basis von Ammoniumchlorid-Lyse Erythrozyten, die eine schnelle Identifizierung von Bakterien und Hefe durch MALDI-TOF-und automatisierte Identifikationssysteme (Abbildung 2) ¹⁵ erlauben entwickelt. Dieses Blutkultur Pelletzubereitung stellen auch eine Probe für andere direkte nachgeschalteten Anwendungen wie Gram-Färbung, automatisierte PCR-basierten diagnostischen Tests wie POCT-PCRs zum schnellen Nachweis von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und antibiotische Resistenzprüfung mit automatisierte AST-Systeme und / oder Plattendiffusionstests auf Agarplatten (Abbildung 3).

In dieser Arbeit wurden die verschiedenen Schritte zur Herstellung des Blutkulturbakterienpellet beschreiben wir, wie durch Prod'hom et al erläutert. ¹⁵ (Figur 4). Wir werden auch DESchreiber die Protokolle für drei der wichtigsten Anwendungen, die auf die Blutkultur Pellet durchgeführt werden können: Identifizierung mittels ^{MALDI-TOF-15,} Identifikation (ID) und Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung (AST) mit den automatisierten Systemen ¹⁶ für Enterobacteriaceae und Staphylokokken und automatisierte PCR- basierten diagnostischen Test zum Nachweis von MRSA ^17.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde entwickelt und validiert nach den Forschung und Entwicklungsprozesse und ethische Regeln unserer Einrichtung, bevor er als Routinewerkzeug implementiert.

1. Herstellung einer Blutkulturbakterienpellet durch Ammoniumchlorid Erythrozyten-Lyseverfahren

1. Vorbereitung einer positiven Blutkultur für nachfolgende Zentrifugation.
   1. Sterilisieren Blutkultur Kappe. Fügen Sie 70% Ethanol auf die Kappe der Flasche und zu brennen.
      HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt unter einer Steril ausführen nicht.
   2. Bewegen Sie die Flasche an einer Steril. Sammeln von 5 ml der Blutkultur mit einer 20 G Spritze.
   3. Fügen Sie die 5 ml Blutkultur in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 45 ml sterilem Wasser (H ₂ O) und die Probe zu mischen.
2. Herstellung einer Blutkultur Bakterienpellet durch Zentrifugation Lyse.
   1. Zentrifugieren der Probe bei 1.000 xg für 10 min bei RT.
   2. Remove Überstand mit einer Labor-Vakuumpumpe (die hauptsächlich H ₂ O und Blutzellen enthält).
   3. Das Pellet in 1 ml hausgemachte Ammoniumchlorid Lyse-Lösung (0,15 M NH ₄ Cl, 1 mM KHCO _3). Brechen die Pellets durch Kratzen und durch Vortexen das Rohr und Zentrifugieren der Probe bei 140 g für 10 min bei RT.
   4. Überstand verwerfen, die hauptsächlich rote Blutkörperchen Schutt.
      1. Wenn die Pellets blieben hämorrhagischen, das Pellet in 2 ml sterilem destilliertem H ₂ 0 weiter lysieren restliche rote Blutzellen und das Pellet zu waschen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 140 g für 10 min bei RT und den Überstand verwerfen.
   5. Resuspendieren des Pellets in 200 ul H ₂ O
3. Subkultur der Blutkultur auf verschiedenen selektiven und nicht-selektiven Agar-Medien.
   1. Sammeln von 1 ml der Blutkultur mit einer 20 G Spritze.
   2. Impfen 1 Tropfen Blutkultur into vier Quadranten auf Blut-Agar, Schokolade-Agar, McConkey Agar-Agar und Schaedler.
   3. Bei 37 ° C wird die Blut-Agar-und Schokoladen-Agar-Platten in einer 5% CO ₂ Atmosphäre, McConkey Agar in einer Normalatmosphäre und die Scha Agarplatte in anaeroben Bedingungen.
   4. Folgen bakterielle Wachstum auf verschiedenen Medien.
   5. Überprüfen Sie für bakterielle Reinheit.

2. Identifizierung durch MALDI-TOF-MS

1. Direkte Identifizierung aus dem Blut Pellets.
   1. Transfer 1 ul Blut Pellet auf einem MALDI-Target Platte und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform.
   2. Überlagern die Probe mit 1 ul 70% iger Ameisensäure und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform.
   3. Überlagern die Probe mit 1 ul MALDI-Matrix (gesättigte Lösung von α-Cyano-4-Hydroxy-Säure in 50% Acetonitril-2.5% Trifluoressigsäure) und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform.
   4. Fahren Sie mit MALDI-TOF-MS-Analyse mit einem MALDI-TOF-MS-System, wie durch den Hersteller beschrieben.
   5. Wenn die Identifikations Punktzahl ist ungültig auf Artenebene (zum Beispiel mit einem Score <2), führen Sie eine Proteinextraktion des Blutes Pelletprobe.
2. Identifikation nach Proteinextraktion aus der Blutkultur Pellets.
   1. Mix 20 ul Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und Zentrifugation bei 13.000 × g für 2 min bei RT.
   2. Überstand verwerfen und fügen Sie 25 ul von 70% Ameisensäure und 25 ul 100% Acetonitril zum Pellet. Vortex kräftig, um die Pellets zu suspendieren. Resuspendieren harten Pellets, indem Sie sie mit Pipettenspitzen vor Verwirbelung.
   3. Zentrifugieren bei 13.000 × g für 2 min bei RT. Übertragung 1 ul der Überstand (die extrahierten Proteine ​​enthalten) auf einem MALDI-Target Platte und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform. Gehen Sie wie in 2.1.2 beschrieben.

3. Bakterielle Identification und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung mit einem automatisierten System-Mikrobielle

1. Herstellung einer Bakteriensuspension zur Identifizierung von Bakterien und AST mit einem automatisierten mikrobiellen Systems.
   1. Vorbereiten einer Kunststoffröhrchen, das 3 ml steriler 0,45% iger NaCl-Lösung mit dem automatisierten mikrobielle System kompatibel.
   2. Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Blutkulturpellet in 0,45% NaCl-Lösung, um eine Bakteriensuspension, entsprechend einer McFarland Trübungs von 0,6 bis 0,8 zu erhalten. Messen Sie die Trübung mit einem Densitometer Maschine.
      HINWEIS: Das Volumen des Blutkulturbakterienpellet variiert von 50 bis 200 ul, um ein McFarland Trübungs von 0,6 bis 0,8 zu erreichen.
2. Impfen die automatisierten Gram-positive (GP) oder Gram-negative (GN) Karten für die Identifikation und die automatisierten AST-Karten für antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Gram-positive Kokken und Gram-negative Bakterien, wie vom Hersteller beschrieben.
   HINWEIS: identifizierun mit GP oder GN-Karten wird nicht angewendet, wenn MALDI-TOF-MS-Identifizierung Score-Wert> 2. Überprüfen Sie die Reinheit der Bakteriensuspension durch Subkultivierung der Bakteriensuspension auf Blutagar (GP und GN) und MacConkey-Agar (GN) Platten.

4. Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung von Festplattendiffusionstest

Die Scheibe Diffusionstest wird von der Europäischen Ausschusses für antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung (EUCAST, Version 3.0, im April 2013 www.eucast.org) beschrieben.

1. Herstellung einer Bakteriensuspension antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von Plattendiffusionstest durchzuführen.
   1. Vorbereiten einer Glasröhrchen mit 3 ml steriler 0,9% NaCl-Lösung.
   2. Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Blutkulturpellet in 0,9% NaCl-Lösung, um eine Bakteriensuspension, entsprechend einer McFarland Trübungs von 0,5 zu erhalten. Messen Sie die Trübung mit einem Densitometer Maschine.
      HINWEIS: Das Volumen der BlutkulturBakterienpellet variiert von 50 bis 200 ul, um ein McFarland Trübungs von 0,6 bis 0,8 zu erreichen.
   3. Mischen Sie den Bakteriensuspension.
2. Inokulation von Bakteriensuspension auf Mueller-Hinton-Agar (MH) oder Mueller-Hinton-Agar-Agar anspruchsvolle Organismen (MHF) (MH, ergänzt mit 5% defibriniertes Pferdeblut und 20 mg / l β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid).
   1. Tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen in der Bakteriensuspension und entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit durch Drehen Sie den Tupfer an der Innenwand der Glasröhre.
   2. Verbreiten Sie die Bakteriensuspension gleichmäßig auf die gesamte Oberfläche des MH / MHF-Agar-Platte durch Tupfen in drei Richtungen oder durch Verwendung eines automatischen Plattendreher.
3. Anwendung von antimikrobiellen Festplatten auf Agar-Platten angeimpft.
   1. Gelten genau die Scheiben auf der Oberfläche der getrockneten geimpft Agar-Platten manuell oder mit Hilfe eines Platten Anfälligkeit Spender.
   2. Die Platte auf der entsprechenden Tempetur und die Atmosphäre wie in der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung EUCAST Plattendiffusionsmethode beschrieben (Version 3.0, im April 2013 www.eucast.org).

5. Automatische PCR-basierten diagnostischen Test zum Nachweis von MRSA

1. Mit einer Mikropipette, Transfer 50 ul der Blutkultur Pellet in die Probenflasche mit dem Reagenz MRSA automatisierte PCR-basierten diagnostischen Test-Kit und Wirbel während 20 Sekunden zur Verfügung gestellt.
2. Verwendung einer 1 ml-Mikropipette zu verzichten, die Probe in die Probenöffnung der Patrone. Setzen Sie die Patrone in den automatisierten PCR-System und starten Sie den Test, wie vom Hersteller beschrieben.

Ergebnisse

In der Studie von Prod'hom et al. ¹⁵ durchgeführt wurden Bakterienpellets durch Ammoniumchlorid-Lyse Zentrifugation von 122 positive Blutkultur von 78 Patienten erhalten durch MALDI-TOF MS analysiert. Von 122 positiven Blutkultur wurden 95 (77,9%) richtig auf Artenebene und eine (0,8%) an der Gattungsebene identifiziert. Die restlichen 26 (21,3%) Blutkultur-Pellets gab keine sichere Identifizierung mittels MALDI-TOF. Unter denen waren 21 gram-positive Bakterien, darunter 13 Streptokokken und 5 K...

Diskussion

Im Vergleich zu herkömmlichen positiven Blutkultur diagnostische Ansätze, die schnelle Beschaffung eines Bakterienpellet mit Hilfe der Ammoniumchlorid-Lyse Zentrifugation Ansatz reduzieren die Zeit, um die Identifizierung von 16 bis 24 h und die Zeit bis AST von 24 bis 48 Stunden zu melden (Abbildungen 1 und berichten 3).

Rasche Einführung von geeigneten Antibiotika-Therapie ist entscheidend, um das Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn zu v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 needle gauge	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar