Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade

Resumo

Uma preparação sedimento bacteriano rápida de uma cultura de sangue positiva pode ser utilizado como uma amostra para aplicações tais como a identificação por MALDI-TOF, a coloração de Gram, teste de susceptibilidade aos antibióticos e ensaios baseados em PCR. Os resultados podem ser rapidamente comunicados aos médicos para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.

Resumo

Infecções da corrente sanguínea e septicemia são uma das principais causas de morbidade e mortalidade. O êxito de pacientes que sofrem de bacteremia depende de uma rápida identificação do agente infeccioso para orientar o tratamento antibiótico ideal. A análise de manchas Gram de hemocultura positiva pode ser rapidamente realizada e já impactar significativamente o regime de antibióticos. No entanto, a identificação precisa do agente infeccioso ainda é necessário para estabelecer o melhor tratamento direcionado. Apresentamos aqui uma preparação pellet bacteriano simples e rápido de uma hemocultura positiva que pode ser usado como um exemplo para várias aplicações a jusante essenciais, como a identificação por MALDI-TOF MS, teste de sensibilidade aos antibióticos (AST) pelo método de difusão de disco ou sistemas automatizados AST e por PCR automatizados baseados em testes de diagnóstico. O desempenho desses sistemas de identificação e AST diferentes aplicados diretamente sobre as culturas de sangue pelotas bacterianas é muito siMilar para o desempenho, normalmente obtido a partir de colónias isoladas cultivadas em placas de agar. Em comparação com métodos convencionais, a rápida aquisição de um sedimento bacteriano, reduz significativamente o tempo de identificação e relatam tanto AST. Assim, seguindo a positividade da hemocultura, identificação por MALDI-TOF podem ser relatados em menos de 1 hora enquanto que os resultados de AST por sistemas automatizados ou AST difusão em disco dentro de 8 a 18 horas, respectivamente. Da mesma forma, os resultados de um ensaio baseado em PCR rápida podem ser comunicadas para os clínicos menos do que 2 horas após o relatório de uma bacteremia. Juntos, estes resultados demonstram que a preparação rápida de um sedimento de bactérias hemocultura tem um impacto significativo sobre o tempo de identificação e AST reviravolta e, portanto, sobre o sucesso de pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.

Introdução

Infecções da corrente sanguínea e septicemia em pacientes hospitalizados são uma das principais causas de morbidade e mortalidade. Assim, a mortalidade relacionada com a corrente sanguínea infecções é observada em cerca de 14% a 37% dos pacientes hospitalizados e pode aumentar para 35% em unidades de terapia intensiva de pacientes ^1-3. A rápida identificação do agente infeccioso é fundamental para orientar o tratamento antimicrobiano ideal e aumentar o êxito da terapia antimicrobiana ^4,5. A análise rápida da coloração Gram da hemocultura positiva já tem um impacto significativo sobre a adaptação da terapia antimicrobiana ^6,7, mas a identificação precisa do agente infeccioso é obrigada a fornecer o tratamento antibiótico mais adequado às pacientes. Por exemplo, diferentes regimes de tratamento antibiótico devem ser implementadas após bacteremia com enterococos e estreptococos que são difíceis de distinguir pela coloração de Gram. Do mesmo modo, a identificação da espécie level é necessária para detectar bactérias Gram enterobactérias negativa que codifica um gene cromossómico ampC que conferem uma maior resistência à β-lactâmicos ^8.

Com uma hemocultura positiva, a abordagem convencional de diagnóstico é a subcultura do agente infeccioso em diferentes placas de ágar, que requer várias horas de incubação adicional identificação prévia com várias abordagens, incluindo testes bioquímicos, o crescimento em diferentes meios seletivos e sistemas de identificação microbiana automatizadas. O tempo para os resultados de um método de diagnóstico convencional é de cerca de 1 a 3 dias.

O surgimento da tecnologia de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF), para a rápida identificação de microrganismos forneceu uma nova ferramenta para identificar rapidamente os microrganismos a partir de colónias que cresceram em placas de agar como também directamente a partir de sangue positiva culturas (Figura 1), ^9-12. The uso de MALDI-TOF para identificar um agente infeccioso a partir de culturas de sangue tem reduzido significativamente o tempo para resultados de alguns minutos em vez de horas e dias exigidos por métodos tradicionais. Como discutido por Croxatto et al. ^13, a eficiência de identificação de MALDI-TOF depende de diferentes parâmetros, incluindo a quantidade e pureza do microrganismo. Estes dois critérios são facilmente obtidos a partir de colónias discretas cultivadas em placas de agar, mas é necessária uma pré-tratamento analítico de enriquecimento bacteriana e purificação de amostras complexas, tais como a cultura de sangue, que contêm vários componentes celulares e de proteínas que podem interferir com a identificação de MALDI-TOF.

Vários métodos de isolamento de microrganismos de cultura do sangue tenham sido utilizados num certo número de estudos, incluindo a saponina ou outro método de detergentes suaves para a extracção ^9,14 bacteriana, método de separação de soro de ^10, a lise métodos de centrifugação ¹² e soluções comercialmente, tais como o kit sepsityper. O nosso laboratório de diagnóstico bacteriológico desenvolveu um simples sangue-cultura preparação sedimento bacteriano à base de cloreto de amónio-lise dos eritrócitos, que permitem uma identificação rápida de bactérias e levedura por MALDI-TOF e sistemas de identificação automáticos (Figura 2) ^15. Esta preparação de pelotas de sangue-cultura também fornecer uma amostra para outras aplicações diretas jusante, tais como coloração de Gram, testes de diagnóstico automatizado com base na PCR, como POCT-PCRs para a detecção rápida de resistente à meticilina Staphylococcus aureus (MRSA), e os testes de sensibilidade aos antibióticos com sistemas automatizados de AST e / ou por ensaios de difusão de disco em placas de agar (Figura 3).

Neste trabalho, nós descrevemos os diferentes passos para a preparação do sedimento bacteriano sangue-cultura, tal como explicado por Prod'hom et al. ¹⁵ (Figura 4). Nós também irá deescriba os protocolos de três das principais aplicações que podem ser executadas no pellet hemocultura: Identificação por MALDI-TOF ^15, a identificação (ID) e teste de sensibilidade aos antibióticos (AST) com os sistemas automatizados ¹⁶ de Enterobacteriaceae e estafilococos e PCR-automatizado teste de diagnóstico baseado na detecção de MRSA ^17.

Protocolo

Este protocolo foi desenvolvido e validado seguindo os processos de pesquisa e desenvolvimento e as normas éticas da nossa instituição antes de ser implementado como uma ferramenta de rotina.

1 Preparação de uma Cultura de sangue bacteriana Pellet por Amônio Procedimento Chloride Erythrocyte-lise

1. Preparação de uma hemocultura positiva para posterior centrifugação.
   1. Esterilizar a tampa hemocultura. Adicionar 70% de etanol na tampa da garrafa e queimá-lo.
      NOTA: Não execute este passo debaixo de uma capela de fluxo laminar.
   2. Mover o frasco para uma câmara de fluxo laminar. Recolha 5 ml da cultura de sangue com uma seringa 20 G.
   3. Adicionar os 5 ml de cultura de sangue em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 45 ml de água estéril (H ₂ O) e agitar a amostra.
2. Preparação de uma cultura de sangue pelete bacteriana por centrifugação a lise.
   1. Centrifuga-se a amostra a 1000 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   2. Remove-se o sobrenadante (que contém principalmente _H2O e células do sangue) com uma bomba de vácuo de laboratório.
   3. Ressuspender o sedimento em 1 ml de cloreto de amónio caseira solução (0,15 M NH ₄ Cl, 1 mM KHCO ₃₎ de lise. Quebrar o sedimento por raspagem e em vortex do tubo e centrifugar a amostra a 140 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   4. Rejeitar o sobrenadante, que contém principalmente detritos de células vermelhas do sangue.
      1. Se o sedimento permaneceu hemorrágico, ressuspender o sedimento em 2 ml de solução estéril destilada e H ₂ 0 para lisar os glóbulos vermelhos mais residuais e para lavar o sedimento. Centrifuga-se a amostra a 140 xg durante 10 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante.
   5. Ressuspender o sedimento em 200 ul de _H2O
3. Subcultura da cultura de sangue em vários meios de ágar seletivo e não seletivo.
   1. Recolha de 1 ml da cultura de sangue com uma seringa 20 G.
   2. Inocular uma gota de hemocultura into quatro quadrantes em ágar-sangue, ágar chocolate, ágar McConkey e ágar Schaedler.
   3. Incubar a 37 ° C, o agar de sangue e as placas de ágar de chocolate em uma atmosfera de _CO2 a 5%, o agar McConkey em atmosfera normal e a placa de ágar Schaedler em condições anaeróbicas.
   4. Siga o crescimento bacteriano na mídia diferente.
   5. Verifique se há pureza bacteriana.

2 Identificação por MALDI-TOF MS

1. Identificação direta do sedimento sangue.
   1. Transferir 1 mL da pelota de sangue em uma placa-alvo MALDI e deixe secar sobre uma plataforma de aquecimento de 42 ° C.
   2. Sobreponha a amostra com ácido fórmico 1 ml de 70% e deixe secar sobre uma plataforma de aquecimento de 42 ° C.
   3. Sobreponha a amostra com 1 ml de matriz MALDI e deixe secar sobre uma plataforma C de aquecimento 42 ° (solução de α-ciano-4-hidroxicinâmico em 50% de acetonitrilo-2.5% de ácido trifluoroacético saturada).
   4. Vá para a MALDI-TOF MS a análise com um sistema de MALDI-TOF MS, como descrito pelos fabricantes.
   5. Se a pontuação de identificação não é válido a nível de espécie (por exemplo, com um score <2), realizar uma extração de proteínas da amostra de sedimento sangue.
2. Identificação após a extracção de proteínas a partir do sedimento da cultura do sangue.
   1. Misturar 20 ul do sedimento com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se a 13.000 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
   2. Descartar o sobrenadante e adicionar 25 ul de ácido fórmico a 70% e 25 mL de 100% de acetonitrilo ao sedimento. Vortex vigorosamente, para voltar a suspender as pelotas. Ressuspender pelotas duras ao dividi-los com pontas de pipeta antes de vórtex.
   3. Centrifuga-se a 13000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Transferir 1 mL do sobrenadante (que contém proteínas extraídas) em uma placa-alvo MALDI e deixe secar sobre uma plataforma de aquecimento de 42 ° C. Proceda como descrito no ponto 2.1.2.

3. bacteriana Identificação e Antibiótico Suscetibilidade Testes com um sistema automatizado Microbial

1. Preparação de uma suspensão bacteriana para a identificação de bactérias e a AST, com um sistema automatizado microbiana.
   1. Preparar um tubo de plástico contendo 3 ml de solução estéril de 0,45% de NaCl compatível com o sistema microbiano automatizado.
   2. Adicionar um volume suficiente da pelete da cultura de sangue em solução de NaCl a 0,45% para se obter uma suspensão bacteriana correspondente para uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8. Medir a turvação, utilizando um densitómetro de máquina.
      Nota: O volume do sedimento bacteriano, cultura do sangue varia de 50 a 200 ul para atingir uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8.
2. Inocular as bactérias Gram-positivas (GP) ou Gram-negativa (GN) cartões automáticos de identificação e os cartões AST automatizadas para testes de susceptibilidade antimicrobiana de cocos Gram-positivos e Gram-negativas, como descrito pelo fabricante.
   NOTA: identification com GP ou cartões de GN não é aplicada se MALDI-TOF MS valor pontuação identificação é> 2. Verifique a pureza da suspensão bacteriana por subcultura a suspensão bacteriana em agar de sangue (GP e GN) e ágar de MacConkey (GN) placas.

4. Antibiótico Teste à Susceptibilidade pelo Disk Diffusion Assay

O ensaio de difusão em disco é descrito pelo Comité Europeu para os testes de susceptibilidade antimicrobiana (EUCAST, versão 3.0, em abril de 2013, www.eucast.org).

1. Preparação de uma suspensão bacteriana para realizar testes de susceptibilidade antimicrobiana pelo método de difusão em disco.
   1. Preparar um tubo de vidro contendo 3 ml de solução estéril de NaCl a 0,9%.
   2. Adicionar um volume suficiente da pelete da cultura de sangue em solução de NaCl 0,9% para obter uma suspensão bacteriana correspondente para uma turbidez de McFarland de 0,5. Medir a turvação, utilizando um densitómetro de máquina.
      NOTA: O volume da cultura de sanguesedimento bacteriano varia de 50 a 200 ul para atingir uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8.
   3. Vortex a suspensão bacteriana.
2. Inoculação de suspensão bacteriana em agar Mueller-Hinton (MH) ou de Mueller-Hinton agar-agar de organismos fastidiosos (MHF) (MH suplementado com 5% de sangue de cavalo desfibrinado e 20 mg / L de β-nicotinamida adenina dinucleótido).
   1. Mergulhar uma mecha de algodão estéril na suspensão bacteriana e cuidadosamente remover o excesso de fluido, rodando a mecha na parede interior do tubo de vidro.
   2. Espalhar a suspensão bacteriana uniformemente sobre toda a superfície da placa de agar MH / MHF por raspagem em três direcções, ou por meio de um rotor placa automatizado.
3. Aplicação de discos antimicrobianos em placas de ágar inoculadas.
   1. Aplicar perto os discos na superfície das placas de agar inoculadas secas manualmente ou utilizando um dispensador de disco de sensibilidade.
   2. Incubar a placa na tempe apropriadoratura e atmosfera, conforme descrito no teste de suscetibilidade método de difusão em disco EUCAST antimicrobiana (Versão 3.0, em abril de 2013, www.eucast.org).

Baseado em PCR 5. automatizado de teste de diagnóstico para a detecção do MRSA

1. Usando uma micropipeta, transferir 50 ul do sedimento de cultura de sangue para dentro do frasco de reagente de amostra fornecido com o MRSA baseada em PCR kit de teste de diagnóstico e automatizado vórtice durante 20 seg.
2. Usando uma micropipeta 1 ml, distribuir a amostra na porta espécime do cartucho. Inserir o cartucho dentro do sistema de PCR automatizado e iniciar o ensaio, tal como descrito pelo fabricante.

Resultados

No estudo realizado por Prod'hom et al. ^15, peletes bacterianas obtidas por lise de cloreto de amónio a centrifugação de 122 cultura sanguínea positiva a partir de 78 doentes foram analisadas por MALDI-TOF MS. Fora de 122 hemocultura positiva, 95 (77,9%) foram corretamente identificados ao nível da espécie e um (0,8%) no nível de gênero. Os restantes 26 (21,3%) pelotas de hemocultura não deu nenhuma identificação confiável por MALDI-TOF. Entre esses, 21 eram bactérias gram positivas,...

Discussão

Comparado aos métodos diagnósticos hemocultura positiva convencionais, a rápida aquisição de um sedimento de bactérias, utilizando o cloreto de amônio lise abordagem centrifugação reduzir o tempo para relatar a identificação por 16 a 24 horas eo tempo para relatar AST por 24-48 horas (Figuras 1 e 3).

A rápida introdução de antibioticoterapia adequada é fundamental para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea. Assim,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 needle gauge	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar