Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos

Resumen

Una preparación rápida sedimento bacteriano de un cultivo de sangre positivo puede ser utilizado como una muestra para aplicaciones tales como la identificación por MALDI-TOF, la tinción de Gram, la prueba de susceptibilidad a los antibióticos y prueba basada en PCR. Los resultados pueden ser comunicados rápidamente a los médicos a mejorar el resultado de pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

Resumen

Infecciones del torrente sanguíneo y sepsis son una causa importante de morbilidad y mortalidad. El resultado exitoso de los pacientes que sufren de bacteremia depende de una rápida identificación del agente infeccioso para guiar el tratamiento antibiótico óptimo. El análisis de la tinción de Gram de hemocultivo positivo puede llevar a cabo con rapidez y ya afecta significativamente el régimen de antibióticos. Sin embargo, todavía se requiere la identificación precisa del agente infeccioso para establecer el tratamiento óptimo de destino. Se presenta aquí una preparación sedimento bacteriano simple y rápido de un cultivo de sangre positivo que puede ser utilizado como una muestra para varias aplicaciones posteriores esenciales tales como la identificación por MALDI-TOF MS, las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) por ensayo de difusión en disco o sistemas automatizados de AST y por PCR automatizado basado en pruebas de diagnóstico. El rendimiento de estos diferentes sistemas de identificación y AST aplicados directamente sobre los sedimentos bacterianos de cultivo de sangre es muy SIMilar con el rendimiento que se obtiene normalmente a partir de colonias aisladas cultivadas en placas de agar. En comparación con los métodos convencionales, la rápida adquisición de un sedimento bacteriano se reduce significativamente el tiempo para reportar tanto la identificación y AST. Así, siguiendo la positividad del cultivo de sangre, identificación por MALDI-TOF puede ser reportado en menos de 1 hora mientras que los resultados de AST por sistemas automatizados AST o ensayos de difusión en disco dentro de 8 a 18 horas, respectivamente. Del mismo modo, los resultados de un ensayo rápido basado en la PCR se pueden comunicar a los médicos a menos de 2 horas tras el informe de una bacteriemia. Juntos, estos resultados demuestran que la rápida preparación de un sedimento bacteriano cultivo de sangre tiene un impacto significativo en el tiempo de identificación y de respuesta AST y por tanto en el resultado exitoso de pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

Introducción

Infecciones del torrente sanguíneo y la sepsis en pacientes hospitalizados son una causa importante de morbilidad y mortalidad. Por lo tanto, se observa la mortalidad relacionada con infecciones del torrente sanguíneo en aproximadamente 14% a 37% de los pacientes hospitalizados y puede aumentar hasta el 35% en las unidades de cuidados intensivos de los pacientes ^1-3. La identificación rápida del agente infeccioso es fundamental para orientar el tratamiento antimicrobiano óptimo y para aumentar el éxito de la terapia antimicrobiana ^4,5. El rápido análisis de la tinción de Gram de hemocultivo positivo ya tiene un impacto significativo en la adaptación de la terapia antimicrobiana ^6,7 pero la identificación precisa del agente infeccioso que se requiere para proporcionar el tratamiento antibiótico más adecuado a las pacientes. Por ejemplo, diferentes regímenes de tratamiento con antibióticos tienen que ser aplicadas tras bacteriemia con enterococos y estreptococos que son difíciles de distinguir por la tinción de Gram. Del mismo modo, la identificación de las especies LevEL es necesario para detectar enterobacterias Gram negativo que codifica un gen cromosómico ampC que confieren una mayor resistencia a β-lactámicos ^8.

Con un hemocultivo positivo, el enfoque de diagnóstico convencional es subcultura del agente infeccioso en diferentes placas de agar, que requiere varias horas de incubación adicional previa identificación con diversos enfoques, incluyendo pruebas bioquímicas, el crecimiento en diferentes medios selectivos y sistemas de identificación microbiana automatizados. El tiempo de los resultados de un enfoque de diagnóstico convencional es de aproximadamente 1 a 3 días.

La aparición de la tecnología de desorción láser asistida por matriz / espectrometría de masas de tiempo de vuelo-ionización (MALDI-TOF) para la identificación rápida de microorganismos ha proporcionado una nueva herramienta para identificar rápidamente los microorganismos de colonias crecidas en placas de agar sino también directamente a partir de sangre positivo culturas (Figura 1) ^9-12. The uso de MALDI-TOF para identificar un agente infeccioso a partir de cultivos de sangre se ha reducido significativamente el tiempo a los resultados a unos pocos minutos en lugar de las horas y los días requeridos por los métodos tradicionales. Como se discutió por Croxatto et al. ^13, la eficiencia de identificación MALDI-TOF se basa en diferentes parámetros, incluyendo la pureza y la cantidad de microorganismo. Estos dos criterios se obtienen fácilmente a partir de colonias discretas cultivadas en placas de agar, pero requiere un tratamiento de pre-analítica para el enriquecimiento bacteriana y purificación a partir de muestras complejas, tales como cultivo de sangre, que contienen múltiples componentes celulares y proteínas que pueden interferir con la identificación MALDI-TOF.

Varios métodos de aislamiento de microorganismos a partir de cultivo de sangre se han utilizado en una serie de estudios que incluyen saponina u otro método detergentes suaves para la extracción bacteriana ^9,14, el método de separador de suero ^10, la lisis métodos de centrifugación ¹² y soluciones comercialmente, tales como el kit de sepsityper. Nuestro laboratorio de diagnóstico bacteriológico ha desarrollado una preparación sedimento bacteriano sencilla hemocultivo a base de cloruro de amonio-lisis de los eritrocitos, que permiten la identificación rápida de bacterias y levaduras por MALDI-TOF y los sistemas de identificación automáticos (Figura 2) ^15. Esta preparación de pellets de hemocultivo también proporcionar una muestra para otras aplicaciones posteriores directos tales como la tinción de Gram, pruebas de diagnóstico basados ​​en PCR automatizados, como el POCT-PCR para la detección rápida de la meticilina-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos con sistemas automatizados de AST y / o por ensayos de difusión de disco en placas de agar (Figura 3).

En este trabajo se describen los diferentes pasos para la preparación del sedimento bacteriano hemocultivos según ha explicado Prod'hom et al. ¹⁵ (Figura 4). También vamos a desescriba los protocolos para tres de las principales aplicaciones que se pueden realizar en el sedimento de la cultura de la sangre: La identificación por MALDI-TOF ^15, la identificación (ID) y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) con los sistemas automatizados ¹⁶ para enterobacterias y estafilococos y PCR automatizada prueba de diagnóstico basado en la detección de MRSA ^17.

Protocolo

Este protocolo ha sido desarrollado y validado después de los procesos de investigación y desarrollo y las normas éticas de nuestra institución antes de ser implementado como una herramienta rutinaria.

1 Preparación de un cultivo de sangre bacteriana Pellet por Amonio Procedimiento Cloruro de eritrocitos-lisis

1. Preparación de una cultura positiva de sangre para su posterior centrifugación.
   1. Esterilizar la tapa hemocultivo. Añadir 70% de etanol en la tapa de la botella y quemarlo.
      NOTA: No realice este paso en una campana de flujo laminar.
   2. Mover la botella a una campana de flujo laminar. Recoger 5 ml del cultivo de la sangre con una jeringa 20 G.
   3. Añadir los 5 ml de cultivo de sangre en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 45 ml de agua estéril (H ₂ O) y mezclar la muestra.
2. Preparación de un cultivo de sangre sedimento bacteriano por lisis centrifugación.
   1. Centrifugar la muestra a 1000 xg durante 10 min a TA.
   2. Remove el sobrenadante (que contiene principalmente H ₂ O y células de la sangre) con una bomba de vacío de laboratorio.
   3. Resuspender el precipitado en 1 ml de cloruro de amonio casero solución de lisis (0,15 M NH ₄ Cl, 1 mM _KHCO3). Divida el sedimento por raspado y agitando con vórtex el tubo y centrifugar la muestra a 140 xg durante 10 min a TA.
   4. Descartar el sobrenadante que contiene principalmente los escombros células rojas de la sangre.
      1. Si el sedimento se mantuvo hemorrágico, resuspender el precipitado en 2 ml de H destilada estéril y ₂ 0 para lisar los glóbulos rojos más residuales y para lavar el sedimento. Centrifugar la muestra a 140 xg durante 10 min a TA y desechar el sobrenadante.
   5. Resuspender el sedimento en 200 l de H ₂ O
3. Subcultura de cultivo de sangre en diversos medios de agar selectivo y no selectivo.
   1. Recoge 1 ml del cultivo de sangre con una jeringa de 20 G.
   2. Inocular 1 gota de hemocultivo into cuatro cuadrantes en agar sangre, agar chocolate, agar McConkey y agar Schaedler.
   3. Incubar a 37 ° C el agar sangre y placas de agar de chocolate en una atmósfera de 5% de CO _2, el agar McConkey en un ambiente normal y la placa de agar Schaedler en condiciones anaeróbicas.
   4. Siga el crecimiento bacteriano en los distintos medios.
   5. Compruebe la pureza bacteriana.

2. identificación por MALDI-TOF MS

1. La identificación directa del sedimento de sangre.
   1. Transferencia de 1 l de la pastilla de sangre en una placa de MALDI objetivo y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C.
   2. Superposición de la muestra con ácido fórmico 1 l 70% y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C.
   3. Superposición de la muestra con 1 l de matriz MALDI y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C (solución de α-ciano-4-hidroxicinámico en acetonitrilo al 50%-un 2,5% de ácido trifluoroacético saturada).
   4. Proceda a MALDI-TOF MS análisis con un sistema MALDI-TOF MS como se describe por los fabricantes.
   5. Si la puntuación de identificación no es válido a nivel de especie (por ejemplo, con una puntuación <2), lleve a cabo una extracción de proteínas de la muestra de sedimento de sangre.
2. Identificación de la proteína después de la extracción del sedimento cultivo de sangre.
   1. Mezclar 20 l de la pastilla con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga a 13.000 xg durante 2 min a TA.
   2. Descartar el sobrenadante y añadir 25 l de ácido fórmico al 70% y 25 l de acetonitrilo al 100% a la pastilla. Vortex vigorosamente para volver a suspender los pellets. Resuspender bolitas duras por romper hacia abajo con puntas de pipeta antes de vórtice.
   3. Se centrifuga a 13.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Transferencia de 1 l del sobrenadante (que contiene proteínas extraídas) en una placa de MALDI objetivo y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C. Proceda como se describe en 2.1.2.

3. bacteriana Identificación y Antibiótico Pruebas de Susceptibilidad con un Sistema Automatizado Microbiana

1. Preparación de una suspensión bacteriana de identificación bacteriana y AST con un sistema automatizado microbiana.
   1. Preparar un tubo de plástico que contiene 3 ml de solución estéril de NaCl al 0,45% compatible con el sistema automatizado microbiana.
   2. Añadir un volumen suficiente de la pastilla de cultivo de sangre en la solución de NaCl 0,45% para obtener una suspensión bacteriana correspondiente a una turbidez McFarland de 0,6 a 0,8. Medir la turbidez usando una máquina de densitómetro.
      NOTA: El volumen del sedimento bacteriano cultivo de sangre varía entre 50 y 200 l para lograr una turbidez McFarland de 0,6 a 0,8.
2. Inocular las automatizados Gram-positivo (GP) o Gram-negativo (GN) tarjetas de identificación y las tarjetas AST automatizados para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana de bacterias cocos Gram-positivos y Gram-negativos como se describe por el fabricante.
   NOTA: Identificación con GP o tarjetas GN no se aplica si MALDI-TOF MS valor de la puntuación de identificación es> 2. Comprobar la pureza de la suspensión bacteriana mediante subcultivo la suspensión bacteriana en agar sangre (GP y GN) y agar MacConkey (GN) placas.

4. antibióticos Pruebas de Susceptibilidad por difusión con discos de ensayo

El ensayo de difusión en disco es descrito por el Comité Europeo de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (EUCAST, Versión 3.0, abril de 2013, www.eucast.org).

1. Preparación de una suspensión bacteriana para realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana mediante el ensayo de difusión en disco.
   1. Preparar un tubo de vidrio que contiene 3 ml de solución estéril de NaCl al 0,9%.
   2. Añadir un volumen suficiente de la pastilla de cultivo de sangre en la solución de NaCl al 0,9% para obtener una suspensión bacteriana correspondiente a una turbidez McFarland de 0,5. Medir la turbidez usando una máquina de densitómetro.
      NOTA: El volumen del cultivo de sangresedimento bacteriano varía entre 50 y 200 l para lograr una turbidez McFarland de 0,6 a 0,8.
   3. Vórtex con la suspensión bacteriana.
2. La inoculación de suspensión bacteriana sobre agar Mueller-Hinton (MH) o agar Mueller-Hinton agar-organismos fastidiosos (MHF) (MH suplementado con 5% de sangre desfibrinada de caballo y 20 mg / l de adenina dinucleótido nicotinamida-β).
   1. Sumergir un hisopo de algodón estéril en la suspensión bacteriana y retirar suavemente el exceso de fluido girando el hisopo en la pared interior del tubo de vidrio.
   2. Corre la suspensión bacteriana de manera uniforme sobre toda la superficie de la placa de agar MH / MHF en muestras de secreciones en tres direcciones o mediante el uso de una placa de rotador automático.
3. Aplicación de los discos antimicrobianos en placas de agar inoculadas.
   1. Aplicar de cerca los discos en la superficie de las placas de agar inoculadas secas manualmente o mediante un dispensador de disco de susceptibilidad.
   2. Incubar la placa a la tempe apropiadaratura ambiente y como se describe en el método de difusión en disco EUCAST las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (versión 3.0, abril de 2013, www.eucast.org).

5. automatizado PCR-basado de prueba de diagnóstico para la detección de MRSA

1. Usando una micropipeta, transferir 50 l de la pastilla de cultivo de sangre en el frasco de reactivo de ejemplo proporcionado con el kit de prueba de MRSA automatizado de diagnóstico basado en la PCR y agitar durante 20 seg.
2. Usando una micropipeta de 1 ml, dispensar la muestra en el puerto de muestra del cartucho. Insertar el cartucho en el sistema de PCR automatizado e iniciar el ensayo como se describe por el fabricante.

Resultados

En el estudio realizado por Prod'hom et al. ^15, sedimentos bacterianos obtenidos por cloruro de amonio lisis centrifugación de 122 hemocultivo positivo de 78 pacientes se analizaron por MALDI-TOF MS. Fuera de 122 hemocultivos positivos, 95 (77,9%) fueron correctamente identificados a nivel de especie y uno (0,8%) a nivel de género. Los 26 (21,3%) Bolitas de hemocultivo restantes no dieron ninguna identificación fiable por MALDI-TOF. Entre ellos, 21 eran bacterias gram positivas incluyendo 13 e...

Discusión

En comparación con los métodos de diagnóstico de hemocultivos positivos convencionales, la rápida adquisición de un sedimento bacteriano utilizando el cloruro de enfoque centrifugación lisis de amonio a reducir el tiempo para informar de identificación en un 16 a 24 horas y el tiempo de reportar AST por 24 a 48 horas (Figuras 1 y 3).

Rápida introducción de la terapia antibiótica adecuada es fundamental para mejorar el pronóstico de los pacientes que sufren de infe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 needle gauge	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar