Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам

Резюме

Быстрое бактериальный препарат гранул с положительной культуры крови может быть использована в качестве образца для таких применений, как идентификации по MALDI-TOF, окрашивание по Граму, тестирование чувствительности к антибиотикам и тест на основе ПЦР. Полученные результаты могут быть быстро доведены до врачей, чтобы улучшить результаты лечения больных, страдающих от инфекций кровотока.

Аннотация

Инфекций кровотока и сепсис являются одной из основных причин заболеваемости и смертности. Успешное завершение пациентов, страдающих от бактериемии зависит от быстрой идентификации инфекционного агента, чтобы вести оптимальное лечение антибиотиками. Анализ грамотрицательных пятна от положительной культуры крови может быть проведено быстро и уже существенно повлиять на режим антибиотиками. Тем не менее, точная идентификация возбудителя инфекции по-прежнему требуется, чтобы установить оптимальный целенаправленного лечения. Приведем здесь простой и быстрый бактериальный препарат гранул с положительной культуры крови, которые могут быть использованы в качестве образца в течение нескольких существенных последовательных применений, таких как идентификация по MALDI-TOF MS, тестирование чувствительности к антибиотикам (АСТ) на диск диффузии анализа или автоматизированных систем AST и автоматизированная основе ПЦР диагностическое тестирование. Производительность этих различных идентификационных и АСТ систем, применяемых непосредственно на посев крови бактериальных гранул очень сиMilar к производительности обычно получают из изолированных колоний, выросших на чашках с агаром. По сравнению с традиционными подходами, быстрое приобретение бактериальной гранул значительно снижает время, чтобы сообщать как идентификацию и АСТ. Таким образом, следующие культура положительность крови, идентификация MALDI-TOF может быть сообщено в течение менее 1 ч, тогда как результаты АСТ автоматизированными системами AST или диск диффузии анализов в пределах от 8 до 18 часов, соответственно. Точно так же результаты экспресс ПЦР-анализа могут быть доведены до сведения врачей менее 2 ч после доклада на карбункул. Вместе, эти результаты показывают, что быстрое приготовление питательной крови бактериальный осадок имеет значительное влияние на идентификации и АСТ выполнения заказа и, таким образом, на успешный исход пациентов, страдающих от инфекций кровотока.

Введение

Инфекций кровотока и сепсис у госпитализированных пациентов являются основной причиной заболеваемости и смертности. Таким образом, смертность от инфекций кровотока наблюдается примерно в 14% до 37% госпитализированных пациента и может увеличиться до 35% в отделениях интенсивной терапии пациентов ^1-3. Быстрое выявление инфекционного агента является ключевым для руководства оптимальное антимикробной терапии и увеличить успешный исход антимикробной ^4,5 терапии. Экспресс-анализ по Граму от положительной культуры крови уже имеет значительное влияние на адаптацию антимикробной терапии ^6,7, но точной идентификации инфекционного агента требуется обеспечить лучший адаптированный лечения антибиотиками для пациентов. Например, различные схемы лечения антибиотиками должны быть реализованы следующие бактериемии с энтерококков и стрептококков, которые трудно отличить от окрашивания Грама. Аналогично, идентификация на видовом ЛевEL требуется для обнаружения грамотрицательных энтеробактерий, кодирующий хромосомной AMPC ген, сообщающий повышенную устойчивость к β-лактамы ^8.

С положительной культуры крови, обычный диагностический подход является субкультура инфекционного агента на разных чашках с агаром, который требует несколько часов дополнительного инкубационного предварительного идентификации с различными подходами в том числе биохимических тестов, роста на различных селективных средах и автоматизированных систем микробной идентификации. Время результатам обычного диагностического подхода является то, приблизительно от 1 до 3 дней.

Появление технологии матрица-лазерной десорбцией / ионизацией время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF) для быстрой идентификации микроорганизмов предоставил новый инструмент для быстрого выявления микроорганизмов из колоний, выросших на чашках с агаром, но и непосредственно от положительной крови культуры (рис 1) ^9-12. Чтэ использование MALDI-TOF для идентификации инфекционного агента из крови значительно сократила время к результатам до нескольких минут, а не часы и дни, требуемых традиционными методами. Как обсуждалось Croxatto соавт. ^13, эффективность идентификации MALDI-TOF зависит от различных параметров, в том числе чистоты и количества микроорганизма в. Эти два критерия легко получаются из дискретных колоний, выросших на чашках с агаром, но требует предварительной аналитической лечение бактериального обогащения и очистки от сложных образцов, таких как культура крови, которые содержат несколько клеточных и белковых компонентов, которые могут помешать идентификации MALDI-TOF.

Методы изоляции различных микроорганизмов »от культуры крови были использованы в ряде исследований, включая сапонина или другим способом мягкие моющие средства для бактериального извлечения ^9,14, метод сыворотки сепаратора ^10, лизиса методы центрифугирования ¹² (Рисунок 2) ^15. Этот препарат крови культура окатышей также предоставить образец для других прямых последовательных применений, таких как окрашивание Грама, автоматизированные диагностические тесты, основанные на ПЦР, такие как POCT-ПЦР для быстрого обнаружения метициллин-устойчивый Staphyloccocus стафилококк (MRSA) и чувствительности к антибиотикам с автоматизированные системы АСТ и / или дисковыми диффузии анализов на чашках с агаром (Рисунок 3).

В этой работе мы описываем различные шаги для подготовки крови культуры бактерий крупинки, как объясняется Prod'hom соавт. ¹⁵ (Рисунок 4). Мы также деписец протоколы для трех основных приложений, которые могут выполняться на культуры крови пеллет: Идентификация по MALDI-TOF ^15, идентификационный (ID) и тестирование чувствительности к антибиотикам (АСТ) с автоматизированными системами ¹⁶ для энтеробактерий и стафилококков и автоматизированной ПЦР диагностический тест основан на обнаружении MRSA ^17.

протокол

Этот протокол был разработан и утвержден следующий процессы исследований и разработок, а также этические правила нашего заведения до начала ее осуществления в качестве обычного инструмента.

1 Подготовка Кровь культуры бактериальный осадок от аммония хлорид эритроцитов-лизирующим процедуры

1. Получение положительной культуры крови для последующего центрифугирования.
   1. Стерилизовать культуры крови крышку. Добавить 70% этанола на крышке бутылки и записать его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте этот шаг под капотом ламинарного потока.
   2. Перемещение бутылку ламинаре. Собирают 5 мл культуры крови с 20 г шприца.
   3. Добавьте 5 мл культуры крови в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 45 мл стерильной воды (H ₂ O) и перемешайте пробу.
2. Приготовление питательной крови бактериальный осадок центрифугированием лизисом.
   1. Центрифуга образца при 1000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
   2. Ремове супернатант (который содержит в основном H ₂ O и клеток крови) с помощью лабораторного вакуумного насоса.
   3. Ресуспендируют гранул в 1 мл самодельного хлорида аммония лизирующих решение (0,15 М NH ₄ Cl, 1 мМ _КНСО3). Пробивное гранул путем соскабливания и при интенсивном перемешивании трубку и центрифуги образца при 140 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
   4. Удалите супернатант, который в основном содержит эритроцитов мусора.
      1. Если гранулы оставались геморрагический, ресуспендируют осадок в 2 мл стерильной дистиллированной воды и ₂ 0 дальнейшего лизиса остаточные красные клетки крови и промывать осадок. Центрифуга образца при 140 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, и отбросить супернатант.
   5. Ресуспендируют гранул в 200 мкл H ₂ O
3. Субкультура культуры крови на различных селективного и неселективного среде агара.
   1. Собирают 1 мл культуры крови с 20 г шприца.
   2. Привить 1 каплю культуры крови междунаро четыре квадранта на кровяной агар, шоколадный агар, McConkey агара и Schaedler агара.
   3. Инкубировать при 37 ° C в кровяной агар и шоколад агаром в 5% СО ₂ атмосферы, агар Мак-Конки в нормальной атмосфере и агаром Schaedler в анаэробных условиях.
   4. Следуйте рост бактерий на различных средах.
   5. Проверьте бактериальной чистоты.

2 Идентификация по MALDI-TOF MS

1. Прямая идентификация из осадка крови.
   1. Передача 1 мкл осадка крови на MALDI целевой пластины и дайте ему высохнуть на 42 ° C отопительной платформы.
   2. Overlay образца с 1 мкл 70% муравьиной кислоты и дайте ему высохнуть на 42 ° C отопительной платформы.
   3. Наложение образца с 1 мкл MALDI матрицы (насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50% ацетонитрил-2,5% трифторуксусной кислоты) и дать высохнуть на 42 ° C нагрева платформы.
   4. Перейдите к MALДИ-TOF МС анализ с помощью системы MALDI-TOF MS, как описано производителем.
   5. Если счет идентификации является недействительным на видовом уровне (например со счетом <2), выполнить извлечение белка в образце пеллет крови.
2. Идентификация после экстракции белка из культуральной крови гранул.
   1. Смешать 20 мкл гранул с 1 мл 70% этанола и центрифугируют при 13000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
   2. Жидкость над осадком сливают и добавляют 25 мкл 70% муравьиной кислоты и 25 мкл 100% ацетонитрила в таблетки. Вихревой энергично ресуспендируют гранул. Ресуспендируют жесткие гранулы, разбивая их вниз с наконечников пипеток до встряхивания.
   3. Центрифуге при 13000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Передача 1 мкл супернатанта (которые содержат извлеченные белки) на MALDI целевой пластины и дайте ему высохнуть на 42 ° C отопительной платформы. Действуйте, как описано в 2.1.2.

3 Бактериальный IDENTIFication и чувствительности к антибиотикам с помощью автоматизированной системы микробной

1. Приготовление бактериальной суспензии для идентификации бактерий и АСТ с автоматизированной системой микробного.
   1. Подготовить пластмассовую трубку, содержащую 3 мл стерильного 0,45% раствора NaCl, совместимого с автоматизированной системой микробного.
   2. Добавить достаточный объем питательной крови гранул в 0,45% растворе NaCl, чтобы получить бактериальной суспензии, соответствующей мутности McFarland 0,6 до 0,8. Измерьте мутности с помощью денситометра машину.
      Примечание: объем культуральной крови бактериальный осадок варьирует от 50 до 200 мкл для достижения мутности McFarland 0,6 до 0,8.
2. Привить автоматизированные грамположительных (GP) или грамотрицательных (GN) карты для идентификации и автоматизированные AST карты для тестирования антимикробной восприимчивости грамположительных кокков и грамотрицательных бактерий, как описано производителем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Identificatioн с терапевтом или GN карт не применяется, если MALDI-TOF MS идентификация оценка значение> 2. Проверьте чистоту бактериальной суспензии путем пересева бактериальной суспензии на кровяной агар (GP и GN) и MacConkey агар (GN) пластин.

4 чувствительности к антибиотикам по диффузии диска Пробирной

Диск диффузии анализ описан Европейским комитетом по антимикробной восприимчивости (EUCAST, Версия 3.0, апрель 2013, www.eucast.org).

1. Приготовление бактериальной суспензии для выполнения антимикробной чувствительности диском диффузии анализа.
   1. Приготовьте стеклянную трубку, содержащую 3 мл стерильного 0,9% раствора NaCl.
   2. Добавить достаточный объем питательной крови гранул в 0,9% растворе NaCl, чтобы получить бактериальной суспензии, соответствующий McFarland мутности 0,5. Измерьте мутности с помощью денситометра машину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем культуры кровиБактериальный осадок варьирует от 50 до 200 мкл для достижения мутности McFarland 0,6 до 0,8.
   3. Vortex бактериальной суспензии.
2. Прививка бактериальной суспензии на Мюллера-Хинтона агар (MH) или Мюллера-Хинтона агар-агар требовательный организмов (MHF) (МН с добавлением 5% дефибринированной лошадиной крови, и 20 мг / л β-никотинамид-аденин-динуклеотид).
   1. Dip стерильного ватного тампона в бактериальной суспензии и осторожно удалить лишнюю жидкость, вращая тампон на внутренней стенке стеклянной трубки.
   2. Распространение бактериальной суспензии равномерно на всей поверхности агаровой пластины MH / минимального теплового потока моечные в трех направлениях, или с помощью автоматизированного пластины ротатор.
3. Применение противомикробных дисков на привитых пластин агара.
   1. Применение внимательно диски на поверхности высушенных инокулированных чашках с агаром вручную или с помощью диска восприимчивость дозатор.
   2. Инкубировать на соответствующем Температура и атмосфера, как описано в тестирования антимикробной восприимчивости методом EUCAST диффузии диска (Версия 3.0, апрель 2013, www.eucast.org).

5 Автоматизированная основе ПЦР диагностической проверки для обнаружения MRSA

1. Использование микропипетки, передать 50 мкл культуральной крови гранул во флакон реагента образца, снабженного MRSA автоматизированной ПЦР-диагностики на основе тест-комплект и вихрь в течение 20 сек.
2. Использование 1 мл микропипетки, обойтись образец в образце порт картриджа. Вставьте картридж в автоматизированной системе ПЦР и начать испытание, как описано производителем.

Результаты

В исследовании, проведенном Prod'hom соавт. ^15, бактериальные осадки, полученные хлорида аммония для лизиса центрифугирования 122 положительной культуры крови от 78 пациентов были проанализированы с помощью MALDI-TOF MS. Из 122 положительных культуры крови, 95 (77,9%) были правильно опреде?...

Обсуждение

По сравнению с обычными положительной культуры крови диагностических подходов, быстрое приобретение бактериальной гранулы с помощью аммония хлорида лизиса центрифугирования подход сократить время, чтобы сообщать идентификацию на 16 до 24 часов, и время, чтобы сообщить AST на 24 до 48 часо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 needle gauge	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar