Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması

Özet

Pozitif kan kültürü hızlı bir Bakteri taneleri bir preparasyon, MALDI-TOF ile tanımlama, Gram boyama antibiyotik duyarlılık testi ve PCR-esaslı testi gibi uygulamalar için bir numune olarak kullanılabilir. Sonuçlar hızla kan dolaşımı enfeksiyonlarından muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmek için klinisyenler için tebliğ edilebilir.

Özet

Kan dolaşımı enfeksiyonları ve sepsis morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Bakteriyemi muzdarip hastaların başarılı bir sonuç optimum antibiyotik tedavisine rehberlik enfeksiyöz ajan hızlı bir tanımlanmasına bağlıdır. Pozitif kan kültürü Gram leke analizi hızla yapılmış ve zaten önemli ölçüde antibiyotik rejimi etkileyebilir edilebilir. Bununla birlikte, enfeksiyöz ajanın doğru tespit hala en iyi hedef tedaviyi saptamak için gereklidir. Burada, disk difüzyon testi ile, MALDI-TOF MS, antibiyotik duyarlılık testi (AST) tarafından tespit edilmesi veya otomatik AST sistemleri gibi çeşitli gerekli alt uygulama için bir numune olarak kullanılabilecek bir pozitif kan kültürü hızlı ve basit bir Bakteri taneleri bir preparasyonunu sunmak ve otomatik diagnostik testi PCR tabanlı. Kan kültürü, bakteriyel pelet üzerine doğrudan uygulanabilir bu farklı kimlik ve AST sistemlerinin performansı çok si olanperformansına Milar normal agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler izole elde. Geleneksel yöntemlere göre, bir bakteri pelet hızlı edinimi önemli ölçüde belirlenmesini ve AST hem rapor süresini azaltır. Böylece, aşağıdaki kan kültürü pozitifliği, MALDI-TOF ile tanımlama 8 içinde sırasıyla 18 saat, otomatikleştirilmiş AST sistemleri veya disk difüzyon deneyleri ile AST sonuçları ise daha az 1 saat içinde rapor edilebilir. Benzer bir şekilde, hızlı, PCR bazlı tahlilin sonuçları klinisyene bakteremi raporu müteakiben en az 2 saat iletilebilir. Birlikte, bu sonuçlar, kan kültürü bakteri pelet hızlı hazırlanması kimlik ve AST geri dönüş süresi ve dolayısıyla kan dolaşımı enfeksiyonları olan hastaların başarılı sonuç üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

Giriş

Hastanede yatan hastalarda kan dolaşımı enfeksiyonları ve sepsis morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Böylece, enfeksiyonlar kan dolaşımına bağlı mortalite hastanede yatan hasta% 37 ila% 14 gözlenir ve yoğun bakım ünitelerinde hasta ^1-3% 35 artabilir. Enfeksiyöz ajan hızlı kimlik optimum antimikrobiyal tedaviyi yönlendirmek ve antimikrobiyal tedavi ^4,5'den başarılı sonucunu artırmak için çok önemlidir. Pozitif kan kültürü Gram lekelerin hızlı analiz zaten antimikrobiyal tedavinin ^6,7 ama enfeksiyöz ajan doğru kimlik uyarlaması üzerinde önemli bir etkiye sahiptir hastalara iyi adapte antibiyotik tedavi sağlamak için gereklidir. Örneğin, farklı antibiyotik tedavi rejimleri enterokok ve Gram boyama ile ayırt etmek zordur streptokoklar ile bakteriyemi takip uygulanması gerekir. Benzer şekilde, türlere tanımlama levEl ^8-laktamlara β karşı arttırılmış bir direnç kazandıran bir kromozom AMPc geni kodlayan, Gram negatif enterobakteriler tespit etmek için gereklidir.

Pozitif kan kültürü ile, geleneksel tanısal yaklaşım biyokimyasal testler, farklı seçici medya büyüme ve otomatik mikrobik tanımlama sistemleri dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar ile ilave inkübasyon öncesinde kimlik birkaç saat gerektirir farklı agar plakaları üzerinde bulaşıcı ajan, altkültürü etmektir. Geleneksel bir yaklaşım teşhis sonuçlarına süresi yaklaşık 1-3 gün taşımaktadır.

Mikroorganizmaların hızlı tespit edilmesi için matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF) teknolojisinin ortaya hızlı bir şekilde pozitif kan şirketinden de agar plakaları üzerinde büyüyen kolonilerin mikroorganizmaların değil tanımlamak için yeni bir aleti kültürler (Şekil 1) ^9-12. ThKan kültürlerinden bir enfeksiyon ajanı tanımlamak için MALDI-TOF E kullanımı önemli bir kaç dakika yerine geleneksel yöntemlerle gerekli saat ve gün sonuçlarına süresini azalttı. Croxatto ve ark. ¹³ tarafından ele alındığı şekilde, MALDI-TOF tanımlama etkinliği mikroorganizmaların saflık ve miktarı da dahil olmak üzere farklı parametrelere dayanır. Bu iki kriter kolaylıkla agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler elde edilen ayrı fakat MALDI-TOF kimlik müdahale edebilir bir çok selüler ve protein bileşenlerini içeren kan kültürü gibi kompleks örnekleri, bakteriyel zenginleştirme ve arıtması için bir ön tedavi analitik gerekmektedir.

Kan kültüründen çeşitli mikroorganizmaların izolasyon yöntemleri bakteriyel çıkarma ^9,14, serum ayırıcı yöntemi ¹⁰ saponin ya da diğer hafif deterjanlar yöntemi dahil, bir çok çalışma kullanılmıştır, lizis santrifüj yöntemleri ¹² ve bu sepsityper kiti gibi ticari çözümleri. Bizim bakteriyoloji tanısal laboratuvar MALDI-TOF ile bakteri ve maya hızlı tanımlama ve otomatik tanımlama sistemleri (Şekil 2) ¹⁵ izin amonyum klorür eritrosit-lizis dayalı basit bir kan kültürü, bakteriyel pelet hazırlık geliştirmiştir. Bu kan kültürü pelet hazırlık aynı zamanda Gram boyama gibi diğer doğrudan aşağı uygulamalar için bir örnek sunmak, metisilin dirençli Staphylococcus aureus hızlı tespiti (MRSA) için POCT-PCR'lerine ve antibiyotik duyarlılık testi gibi otomatik PCR tabanlı tanı testleri AST otomatik sistemleri ve / veya agar plakaları üzerinde disk difüzyon deneyleri (Şekil 3) ile incelenmiştir.

Prod'hom ve arkadaşları tarafından açıklandığı gibi, bu çalışmada, kan kültürü bakteryel tanelerin hazırlanması için farklı adımları açıklar. ¹⁵ (Şekil 4). Biz de de olacakkâtip kan kültürü pelet yapılabilir ana üç uygulama için protokoller: otomatik Enterobacteriaceae için sistemleri ¹⁶ ve stafilokok ve otomatik PCR-ile MALDI-TOF ^15, kimlik (ID) ve antibiyotik duyarlılık testi (AST) tarafından Identification MRSA ^17'nin saptanması için tanısal test göre.

Protokol

Bu protokol geliştirilmiş ve rutin bir aracı olarak uygulamaya geçirilmeden önce kurumun araştırma ve geliştirme süreçleri ve etik kurallarını takip valide edilmiştir.

Amonyum Klorür Eritrosit parçalayan Usulü ile bir Kan Kültürü Bakteriyel Pelet 1. Hazırlık

1. Daha sonra santrifüjleme için pozitif kan kültürünün hazırlanması.
   1. Kan kültürü kapağını sterilize edin. Şişenin kapağı üzerinde% 70 etanol ekleyin ve yakmak.
      NOT: Bir laminer akış kaputun altında bu adımı yapmayın.
   2. Laminar akış için şişe taşıyın. 20 G şırınga ile kan kültürü 5 ml toplayın.
   3. Steril su _(H2O) 45 ml içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne kan kültür 5 ml ilave edilir ve örnek karıştırın.
2. Liziz santrifüjleme ile kan kültürü bakteryel tanelerin hazırlanması.
   1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin.
   2. Remolaboratuar vakum pompası ile (özellikle _H2O ve kan hücreleri içeren) süpernatant ettik.
   3. Solüsyonu (0.15 M _NH4CI, 1 mM KHCO ₃₎ yokedici ev yapımı amonyum klorür 1 ml pelletini. Kazıyarak ve tüp vorteks pelet bölmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 140 x g'de santrifüjleyin.
   4. Ağırlıklı olarak kırmızı kan hücreleri enkaz içeren süpernatant atın.
      1. Topak hemorajik gerçekleşmemesi durumunda, başka bir artık kırmızı kan hücreleri lize etmek için ve pelet yıkamak için steril damıtık H ₂ 0 2 ml pelletini. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 140 x g'de santrifüjleyin ve süpernatant atılır.
   5. _H2O 200 ul pelletini
3. Çeşitli seçici ve seçici olmayan agar ortamında kan kültürünün alt kültür.
   1. 20 G şırınga ile kan kültürü 1 ml toplayın.
   2. Kan kültürü int 1 damla aşılamakkan agar, çikolata agar, McConkey agar ve Schaedler agar dört kadran o.
   3. % 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C'de kan agarı ve çikolata agar plakaları inkübe, normal bir atmosferde Mc Conkey agar ve anaerobik koşullarda Schaedler agar.
   4. Farklı medya üzerinde bakteri büyümesini izleyin.
   5. Bakteriyel saflık için kontrol edin.

MALDI-TOF MS ile 2. Tanımlama

1. Kan pelet doğrudan tanımlama.
   1. Transferi 1 MALDI hedef plaka üzerinde kan pelet ul ve 42 ° C ısıtma platformu üzerinde kurumaya bırakın.
   2. 1 ul% 70 formik asit ile örnek Yerleşimi ve 42 ° C ısıtma platformu üzerinde kurumaya bırakın.
   3. MALDI matris 1 ul numuneyi, kaplama ve bir 42 ° C ısıtma platform üzerinde kurumasına izin (α-siyano-4-hidroksisinamik asetonitril-% 2.5 trifloroasetik asit,% 50 asit çözeltisi, doymuş).
   4. MAL geçinÜretici tarafından tarif edildiği gibi, bir MALDI-TOF MS sistemi DI-TOF MS analizi.
   5. Kimlik puanı (puan <2 ile örneğin) tür düzeyinde geçersiz ise, kan numunesinin pelet bir protein çıkarımı gerçekleştirin.
2. Kan kültürü topağından proteini ekstraksiyon işleminden sonra tanımlanması.
   1. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 13000 x g'de 70% etanol ve 1 ml santrifüj ile pelet 20 ul karıştırın.
   2. Süpernatant atılır ve% 70 formik asit ve 25 ul pelet% 100 asetonitril 25 ul ekle. Vortex şiddetle pelet tekrar süspansiyon. Vorteks önce pipet uçları ile onları parçalayarak sert pelet süspanse.
   3. Oda sıcaklığında 2 dakika için 13,000 x g'de santrifüjleyin. Aktarım 1, bir MALDI hedef plaka üzerinde yüzer ul (ekstre proteinleri ihtiva etmektedir) ve 42 ° C'de ısıtma platformunda kurumaya bırakın. 2.1.2 anlatıldığı gibi devam edin.

3. Bakteriyel IDENTIFBir Otomatik Mikrobiyal Sistemi ile ication ve Antibiyotik Duyarlılık Testleri

1. Otomatik bir sistem ile bakteriyel mikrobiyal kimlik ve AST için bakteriyel süspansiyonun hazırlanması.
   1. Mikrobiyal otomatik sistem ile uyumlu steril% 0.45 NaCI çözeltisi 3 ml içeren plastik bir tüp hazırlanır.
   2. 0,6-0,8 bir McFarland bulanıklığa tekabül eden bir bakteri süspansiyonu elde etmek için% 0,45 NaCl çözeltisi içinde kan kültürü pelet yeterli hacim. Bir densitometer makine kullanarak bulanıklığı ölçün.
      Not: Kan kültürü bakteri topağın hacminin 0,6-0,8 bir McFarland bulanıklık elde etmek için 50 ila 200 ul arasında değişir.
2. Üretici tarafından tarif edildiği şekilde tanımlanması için otomatik Gram-pozitif (GP) veya Gram-negatif (GN) kartları ve Gram pozitif koklar ve Gram-negatif bakterilerin antibiyotik duyarlılık testi için otomatik AST kartları inoküle.
   NOT: identificatioMALDI-TOF MS kimlik skor değeri> 2 ise n GP veya GN kartlarla uygulanmaz. Kan agar (GP ve GN) ve MacConkey agarı (GN) plakaları üzerinde bakteri süspansiyonu alt-kültürleme ile bakteri süspansiyonu saflığını kontrol edin.

Disk Difüzyon Testi ile 4. Antibiyotik Duyarlılık Testleri

Disk difüzyon deneyi antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST, Sürüm 3.0 Nisan 2013 www.eucast.org) Avrupa komitesi tarafından açıklanmıştır.

1. Bakteriyel süspansiyonun hazırlanması disk difüzyon deneyi ile antimikrobiyal duyarlılık testleri.
   1. Steril% 0.9 NaCl çözeltisi, 3 ml ihtiva eden bir cam tüp hazırlanır.
   2. 0.5 McFarland bulanıklığa tekabül eden bir bakteri süspansiyonu elde etmek için% 0.9 NaCI çözeltisi içinde kan kültürü pelet yeterli hacim. Bir densitometer makine kullanarak bulanıklığı ölçün.
      NOT: Kan kültürü hacmiBakteriyel küçük topak, 0,6-0,8 arasında bir McFarland bulanıklık elde etmek için 50 ila 200 ul arasında değişir.
   3. Bakteriyel süspansiyonun vorteksleyin.
2. Mueller-Hinton agar (MH) veya Mueller-Hinton agar-agar titiz organizmalar (TKF) üzerine bakteri süspansiyonu aşılanması (MH,% 5 at kanı defibrine ve 20 mg / β-nikotinamid adenin dinükleotid L ile takviye edilmiştir).
   1. Bakteriyel süspansiyon içinde bir steril pamuklu çubuk daldırma ve hafifçe cam tüpün iç duvarında çubukla çevirerek fazla sıvıyı çıkarın.
   2. Üç yönde silmeli veya otomatik bir plaka rotator ile MH / TKF agar levhasının tüm yüzeyi üzerine eşit şekilde yayılır bakteri süspansiyonu.
3. Aşılanmış agar plakaları üzerinde antimikrobiyal disklerin uygulanması.
   1. El ile kurutuldu, aşılanmış agar plakalarının yüzeyi üzerine veya bir duyarlılık bir disk dağıtıcısı kullanılarak yakından diskleri uygulanır.
   2. Uygun tempe inkübe plakasıdüşene ve antimikrobiyal duyarlılık testi EUCAST disk difüzyon yöntemi tarif edildiği gibi atmosfer (Sürüm 3.0 Nisan 2013 www.eucast.org).

5. Otomatik MRSA Belirlenmesi için Tanı Testi PCR tabanlı

1. Bir mikropipet kullanarak, 20 sn boyunca PCR tabanlı tanı test kiti ve vorteks otomatik MRSA ile sağlanan örnek reaktif şişenin içine kan kültürü pelet 50 ul aktarın.
2. 1 ml'lik bir mikropipet kullanılarak kartuşun örnek portuna numuneyi dağıtmak. PCR sisteminin otomatik olarak kartuşunun takılması ve üretici tarafından tarif edildiği gibi tahlil başlar.

Sonuçlar

Prod'hom ve ark. ¹⁵ tarafından yapılan çalışmada, 78 hastadan 122 pozitif kan kültürü amonyum klorür liziz santrifüj ile elde edilen bakteriyel peletler MALDI-TOF MS ile analiz edilmiştir. 122 pozitif kan kültürü üzerinden, 95 (% 77.9) doğru cins düzeyinde tür düzeyinde ve bir (% 0.8) olarak tespit edilmiştir. Geri kalan 26 (% 21.3), kan kültürü topaklar, MALDI-TOF ile güvenilir bir kimlik verdi. Bunlar arasında, 21 13 streptokok ve 5 koagülaz-negatif stafilokok içeren ...

Tartışmalar

Geleneksel pozitif kan kültürü tanı yaklaşımları ile karşılaştırıldığında, amonyum klorür parçalama santrifüj yaklaşımı kullanarak bakteriyel pelet hızlı edinimi 24 saat ve 48 saat 24 ile AST rapor süresi (Şekil 1 ve 16'dan kimlik rapor süresini azaltmak 3).

Uygun antibiyotik tedavisi hızlı bir giriş kan dolaşımı enfeksiyonları muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmek esastır. Böylece, yaklaşık 8 ila 16 saat ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 G needle	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar