빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조

요약

양성 혈액 배양에서 빠른 박테리아 펠렛 제제는 MALDI-TOF에 의해 식별, 그람 염색, 항생제 감수성 시험 및 PCR-기반 테스트와 같은 애플리케이션을위한 샘플로서 이용 될 수있다. 결과는 급속 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하기 위해 임상에 통신 될 수있다.

초록

혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 균혈증 고통받는 환자의 성공적인 결과는 최적의 항생제 치료를 안내 할 수있는 감염원의 빠른 식별에 따라 달라집니다. 긍정적 인 혈액 배양에서 그람 얼룩의 분석은 신속하게 실시 이미 크게 항생제 처방에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 감염원의 정확한 식별은 여전히​​ 최적의 치료 대상을 설정할 필요가있다. 여기서 이러한 디스크 확산 분석에 의한 MALDI-TOF MS, 항생제 감수성 검사 (AST)에 의해 식별 또는 자동화 AST 시스템과 같은 여러 가지 에센셜 하류 애플리케이션 용 시료로 사용 될 수있는 양성 혈액 배양에서 간단하고 빠른 박테리아 펠렛 제제를 제시 그리고 자동으로 진단 검사를 PCR 기반. 혈액 배양 박테리아 펠릿에 직접 적용이 다른 식별 및 AST 시스템의 성능은 매우 SI이며성능 밀라 (milar)는 일반적으로 한천 플레이트에 성장 고립 식민지에서 얻을. 종래의 방법에 비해 박테리아 펠릿 신속한 취득이 크게 식별 및 AST 모두를보고하는 시간을 감소시킨다. 따라서, 다음과 같은 혈액 배양 양성, MALDI-TOF에 의한 식별은 8 내에서 각각 18 시간, 자동화 된 AST 시스템 또는 디스크 확산 분석에 의해 AST의 결과 반면 미만 1 시간 이내에보고 할 수 있습니다. 마찬가지로 신속한 PCR 기반 분석의 결과는 임상의에게 균혈증 리포트 다음, 2 시간 미만을 통신 할 수있다. 함께, 이러한 결과는 혈액 배양 박테리아 펠릿 신속한 준비 식별 및 AST 턴어라운드 시간에 따라서 혈류 감염으로 고통받는 환자의 성공적인 결과에 상당한 영향을 미치고 있음을 보여준다.

서문

입원 환자의 혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 따라서, 감염 혈액과 관련된 사망률은 입원 환자의 37 %로 약 14 %에서 관찰되며, 중환자 실 환자의 ^{1 ~} 35 %로 증가 할 수 있습니다. 감염원의 신속한 식별 최적 항균 치료를 안내와 항균 치료 ^4,5의 성공적인 결과를 증가시키는 중추적이다. 양성 혈액 배양에서 그람 얼룩의 신속한 분석은 이미 항균 요법 ^6,7하지만 감염원의 정확한 식별 적응에 큰 영향을 갖는 환자에게 가장 적합한 항생제 치료를 제공해야한다. 예를 들어, 다른 항생제 치료법은 장내 및 그람 염색으로 구별하기 어려운 구균 균혈증 다음으로 구현되어야한다. 마찬가지로, 종의 식별 레프엘은 ^8-락탐을 β하기 위해 증가 된 저항성을 염색체의 AmpC 유전자를 코딩하는 그람 음성 장내 세균을 검출하는 데 필요합니다.

긍정적 인 혈액 배양으로, 기존의 진단 방법은 생화학 검사, 다른 선택 배지에 성장과 자동화 된 미생물 식별 시스템을 포함한 다양한 방법으로 추가 배양 전에 식별 몇 시간을 필요로 다른 한천 접시에 감염원을 배양하는 것입니다. 종래의 진단 방법의 결과 시간은 약 1-3일이다.

미생물의 신속한 식별을위한 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분석 (MALDI-TOF) 기술의 출현은 신속 양성 혈액으로부터 직접 또한 아가 플레이트상에서 성장한 콜로니로부터 미생물하지만을 식별하는 새로운 도구를 제공했다 문화 (그림 1) ^9-12. 목혈액 배양에서 감염원을 확인하기 MALDI-TOF의 전자의 사용은 크게 몇 분 대신 전통적인 방법에 의해 요구되는 시간과 일에 결과 시간을 단축하고있다. Croxatto 외. ^(13)에 의해 논의 된 바와 같이, MALDI-TOF 식별 효율은 미생물의 순도 및 양을 포함하여 다른 매개 변수에 의존한다. 이 두 기준은 쉽게 한천 플레이트에 성장 이산 식민지에서 얻은하지만, MALDI-TOF 식별을 방해 할 수있는 여러 세포와 단백질 구성 요소를 포함하는 혈액 배양 등 복잡한 시료에서 세균 농축 및 정제를위한 사전 분석 치료를해야합니다.

혈액 배양에서 다양한 미생물 '분리 방법이 세균 추출 ^9,14, 혈청 분리 방법 ¹⁰ 사포닌 또는 다른 중성 세제 방법을 포함하여 다수의 연구에서 사용 된, 용해 원심 분리 방법 ¹² 등 sepsityper 키트 상업적으로 솔루션을 제공합니다. 우리의 세균학 진단 ​​실험실은 MALDI-TOF에 의한 박테리아와 효모의 빠른 식별 및 자동 식별 시스템 (그림 2) ^15를 허용 염화 암모늄 적혈구 - 용해를 기반으로 간단한 혈액 배양 세균 펠렛 제제를 개발했다. 이 혈액 문화 펠릿 준비 또한 그람 염색 등의 직접 다운 스트림 애플리케이션을위한 샘플을 제공, 같은 메티 실린 내성 Staphyloccocus 구균의 신속한 검출 (MRSA)에 대한 POCT-PCR들과 함께 항생제 감수성 검사와 같은 자동화 된 PCR 기반의 진단 테스트 자동화 된 AST 시스템 및 / 또는 한천 플레이트에 디스크 확산 분석 (그림 3)에 의해.

Prod'hom 등에 의해 설명 된 바와 같이이 작품에서, 우리는 혈액 배양 세균 펠렛의 제조를위한 여러 단계를 설명합니다. ¹⁵ (그림 4). 우리는 또한 탈 것서기관 혈액 배양 펠릿에서 수행 할 수있는 주요 응용 프로그램의 세 가지에 대한 프로토콜 : 자동 장내 세균에 대한 시스템 ¹⁶ 및 포도상 구균 및 자동 PCR-와 MALDI-TOF ^15, 식별 (ID) 및 항생제 감수성 검사 (AST)에 의해 확인 MRSA ^(17)의 검출에 기초하여 진단 테스트.

프로토콜

이 프로토콜 개발 도구 루틴으로서 구현되기 전에 본원의 연구 개발 프로세스 및 윤리 규칙에 따라 확인되었다.

염화 암모늄 적혈구 - 용균 절차에 의한 혈액 문화 세균 펠렛의 1 준비

1. 이후 원심 분리에 대한 긍정적 인 혈액 배양의 준비.
   1. 혈액 배양 뚜껑을 소독. 병의 뚜껑에 70 % 에탄올을 추가하고 구울 수 있습니다.
      참고 : 층류 후드에서이 단계를 수행하지 마십시오.
   2. 층류 후드에 병을 이동합니다. 20 G 주사기와 혈액 배양 5 ㎖를 수집합니다.
   3. 멸균 물 (H ₂ O)의 45 ML을 포함하는 50 ㎖의 원심 분리 관에 혈액 배양의 5 ML을 추가하고 샘플을 섞는다.
2. 용해 원심 분리하여 혈액 배양 세균 펠렛의 제조.
   1. RT에서 10 분 동안 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
   2. 레모실험실 진공 펌프 (주로 H ₂ O 및 혈액 세포를 포함) 상등액을했습니다.
   3. 용액 (0.15 M _NH4Cl 등, 1 ㎜ KHCO ₃₎ 용균 수제 암모늄 클로라이드 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 긁어 튜브 텍싱하여 펠릿을 분해하고 실온에서 10 분 동안 140 XG에서 샘플을 원심 분리기.
   4. 주로 적혈구 파편이 포함 된 상층 액을 버린다.
      1. 펠릿 출혈성 남아 있다면, 상기 잔류 적혈구 세포를 용해하고, 펠릿을 세척 및 멸균 증류수 H ₂ 0 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 실온에서 10 분 동안 140 XG에서 샘플을 원심 분리기 상층 액을 버린다.
   5. H ₂ O의 200 μL에 펠렛을 재현 탁
3. 다양한 선택과 비 선택 한천 미디어에 혈액 문화의 하위 문화.
   1. 20 G 주사기와 혈액 배양 1 ㎖를 수집합니다.
   2. 혈액 배양 INT 1 방울을 접종혈액 한천, 초콜릿 한천, McConkey의 한천 Schaedler 한천에 네 사분면 오.
   3. 5 % CO ₂ 분위기에서 37 ° C에서 혈액 한천와 초콜릿 한천 플레이트를 품어, 정상적인 분위기에서 McConkey 한천 및 혐기성 상태에서 Schaedler 한천 플레이트.
   4. 다른 매체에 세균의 성장을 따르십시오.
   5. 세균의 순도를 확인합니다.

MALDI-TOF MS에 의해 2 식별

1. 혈액 펠릿에서 직접 확인.
   1. 전송 한 MALDI 대상 접시에 혈액 펠릿의 μL와 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면.
   2. 1 ㎕의 70 % 포름산으로 샘플을 오버레이와 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면.
   3. MALDI 매트릭스의 1 ㎕의 시료를 오버레이 및 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면 (α-시아 노 - 사 - 히드 록 아세토 니트릴 - 2.5 % 트리 플루오로 아세트산 50 %에서 산의 포화 용액).
   4. MAL에 진행제조 업체에 의해 기술 된 바와 같이 MALDI-TOF MS 시스템과 DI-TOF MS 분석.
   5. 식별 점수 (점수 <2 인스턴스) 종 레벨에서 유효하지 않은 경우, 피 펠릿 시료 단백질 추출을 수행한다.
2. 혈액 배양 펠릿에서 단백질을 추출 후 확인.
   1. RT에서 2 분 동안 13,000 XG에 70 % 에탄올 1 ml의 원심 분리와 펠렛의 20 μl를 섞는다.
   2. 뜨는을 취소하고 70 % 포름산 25 ㎕의 펠릿 100 % 아세토 니트릴의 25 μl를 추가합니다. 소용돌이 적극적으로 펠릿을 재현 탁합니다. 소용돌이로 교반하기 전에 피펫 팁을 나누어서 힘든 알약을 재현 탁.
   3. 실온에서 2 분 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 전송 한 MALDI 대상 접시에 뜨는 ㎕의 (추출 된 단백질을 포함한다) 및 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면. 2.1.2에 설명 된대로 진행합니다.

3 세균성 지문을 확인해자동화 된 미생물 시스템과 가스화 및 항생제 감수성 검사

1. 자동화 된 미생물 시스템과 박테리아 식별 및 AST에 대한 세균 현탁액의 준비.
   1. 자동화 된 미생물 시스템과 호환 멸균 0.45 % NaCl 용액 3 ㎖를 함유하는 플라스틱 관을 준비한다.
   2. 0.6-0.8의 맥팔랜드 탁도에 대응 세균 현탁액을 얻기 위해 0.45 % NaCl 용액으로 혈액 배양 펠렛의 충분한 볼륨. 농도계 기계를 사용하여 탁도를 측정한다.
      참고 : 혈액 배양 세균 펠릿의 부피는 0.6-0.8의 맥팔랜드 탁도를 달성하기 위해 50 ~ 200 μL에 따라 다릅니다.
2. 제조자에 의해 설명 된대로 식별 자동화 그람 양성 (GP) 또는 그람 음성 (GN) 카드 및 그람 양성 구균 및 그람 음성 세균의 항균 감수성 테스트에 대한 자동화 된 AST 카드를 접종한다.
   참고 : IdentificatioMALDI-TOF MS 식별 점수 값이>이 경우 N GP 또는 GN 카드 적용되지 않습니다. 혈액 한천 (GP와 GN)와 MacConkey 한천 (GN) 접시에 세균 현탁액을 계대 배양하여 세균 현탁액의 순도를 확인합니다.

디스크 확산 분석하여 4 항생제 감수성 검사

디스크 확산 분석은 항균제 감수성 시험 (EUCAST, 버전 3.0 년 4 월 2013 www.eucast.org)에 관한 유럽위원회에 의해 설명된다.

1. 세균 현탁액을 준비 디스크 확산 분석에 의한 항균제 감수성 시험을 수행 할 수 있습니다.
   1. 멸균 된 0.9 % NaCl 용액 3 ㎖를 함유 유리 튜브를 준비한다.
   2. 0.5 맥팔랜드 탁도에 대응 세균 현탁액을 얻기 위해 0.9 % NaCl 용액에 혈액 배양 펠렛의 충분한 볼륨. 농도계 기계를 사용하여 탁도를 측정한다.
      참고 : 혈액 배양의 부피세균 펠릿은 0.6-0.8의 맥팔랜드 탁도를 달성하기 위해 50 ~ 200 μL에 따라 다릅니다.
   3. 세균 현탁액을 소용돌이.
2. 뮬러 - 힌튼 한천 (MH) 또는 뮬러 - 힌튼 한천 - 까다로운 생물 한천 (MHF) 위에 세균 현탁액의 예방 접종은 (MH 5 % defibrinated 말의 혈액과 20 밀리그램 / β-니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드의 L 보충).
   1. 세균 현탁액 멸균 면봉을 찍어 부드럽게 유리 튜브의 내부 벽에 면봉을 돌려 초과 액체를 제거합니다.
   2. 세 방향 보라고하거나 자동화 플레이트 회 전자를 사용하여 MH / MHF 한천 플레이트의 전체 표면 상에 고르게 세균 현탁액을 확산.
3. 접종 한천 접시에 항균 디스크의 응용 프로그램입니다.
   1. 수동 건조 접종 아가 플레이트의 표면 또는 감수성 디스크 디스펜서를 사용하여 밀접하게 디스크를 적용한다.
   2. 해당 템피에서 접시를 품어rature 및 항균제 감수성 시험 EUCAST 디스크 확산법에 설명 된대로 분위기 (버전 3.0 년 4 월 2013 www.eucast.org).

(5) 자동 MRSA의 검출에 대한 진단 검사를 PCR 기반

1. 마이크로 피펫을 사용하여 20 초 동안 PCR 기반의 진단 테스트 키트와 소용돌이를 자동화 MRSA와 함께 제공되는 샘플 시약 병으로 혈액 배양 펠릿의 50 μl를 전송합니다.
2. 1 ML의 마이크로 피펫을 사용하여, 카트리지의 시험편 포트에 샘플을 조제. 자동화 된 PCR 시스템에 카트리지를 삽입하고 제조자에 의해 설명 된대로 분석을 시작합니다.

결과

Prod'hom 외. ^(15)에 의해 수행 된 연구에서, 78 명의 환자에서 122 양성 혈액 배양의 염화 암모늄의 용해를 원심 분리에 의해 얻어진 박테리아 펠릿은 MALDI-TOF MS로 분석 하였다. 122 긍정적 인 혈액 배양 중, 95 (77.9 %)이 올바르게 속 수준에서 종 수준과 하나 (0.8 %)에서 확인되었다. 나머지 26 (21.3 %), 혈액 배양 펠릿은 MALDI-TOF에 의한 신뢰성있는 식별을주지 않았다. 그 중, 21은 13 연쇄상 구...

토론

종래 양성 혈액 배양 진단 방법에 비해, 염화 암모늄 용해 원심 분리 방법을 이용하여 세균 펠렛의 빠른 획득은 24 시간 및 48 시간에 24 의한 AST를보고 할 때 (도 1 및 16에 의해 식별을보고하는 시간을 단축 3).

적절한 항생제 치료의 도입은 빠른 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 향상시키기 위해 중요한 것이다. 따라서, 약 8-16 시간에서 얻은 빠?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 needle gauge	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar