在新生小鼠静脉注射

摘要

儿科疾病的动物模型可以体验早期发病和严重的疾病进展。临床相关治疗交付给年轻小鼠模型可以在技术上难度。这个协议描述了一种非侵入性的静脉内注射的方法在生命的最初2日龄新生小鼠。

摘要

静脉注射是一种临床应用的方式提供治疗。对于成年啮齿类动物和大型动物，静脉注射在技术上是可行的程序。然而，一些小鼠模型可以有早发性疾病具有病情进展快，使潜在疗法的管理难度。的时间（或面部）静脉只是前耳芽在小鼠和显然对于前两天可见在出生后的头使用解剖显微镜的任一侧。在此窗口中，颞静脉可以与体积可达50微升注射。注射是安全的，由两个幼仔和堤坝的耐受性良好。一种典型的注射过程中1-2分钟，在此之后，小狗返回到笼中完成。到了第三日龄静脉是很难想象和注射过程在技术上变得不可靠。这一技术已被用于递送的腺相关病毒（AAV）VECT口服补液盐，这反过来又可以用于根据所述病毒血清型所选择的动物的生活提供几乎全身性的，稳定的转基因表达。

引言

递送治疗剂到在儿科疾病的鼠模型中的中枢神经系统（CNS）中的仍然是一个挑战。小鼠模型中的新生疾病状态是矮小和发育不成熟，因此可能难以直接注入在中枢神经系统内的适当的结构。血管内注射的治疗剂是一种非侵入性的，良好耐受的方法，提供的细胞，药物，或病毒载体的整个身体，包括中枢神经系统^1-5和视网膜^3,5-9。以前的出版物描述了使用透^10,11颞面部静脉注射，无需解剖镜下^11,12，还是需要两个人来注入^10。在这个协议中所描述的注射技术是有利的，因为一个人可以注入幼仔，和光源，以查看颞静脉没有触摸小狗，省去了手术带或小狗的连接到一个固定的表面诸如透射^11。输送的腺相关病毒载体的血清型9（AAV9）在小鼠中产生强大的表达在神经元和星形胶质细胞的整个大脑和脊髓（ 图1）。血管内递送病毒载体到颞浅面静脉已被可靠地使用在各种研究中新生小鼠治疗小儿神经肌肉病脊髓性肌萎缩^{（SMA），2,4,13,14，}并最终增加了处理的小鼠的寿命。

血管内注射新生小鼠也有效地靶向外周神经系统和外周器官（ 图2）。以下注射的AAV，背根神经节，肝脏，心脏，骨骼肌，肺和肠的肠肌丛的转导已观察^{1,3,6,7,15。}中枢神经系统和周围的广泛传导，使理想的注射这种方法需要对全球的疾病表现转基因，比如高雪氏病¹⁶和其他溶酶体贮积病^17,18，巴滕病和相关的神经元蜡样^{lipofuscinoses，19}和巴比二氏综合征，一种遗传性多系统疾病发病的早期儿童²⁰出现的症状。血管内注射到新生小鼠中，也应考虑作为新的建模系统范围的儿科疾病的方法。这种技术已被翻译为较大的动物模型^5,21和血管内注射已经存在作为递送治疗剂的临床上可接受的方法。

目前的协议描述了通过颞浅静脉脸上交付代理商新生小鼠不晚于产后第2天注射一种简单，有效的方法，可以通过一个单一的完成，实行个人和既受两个幼崽和水坝的耐受性。幼崽体验最小痛苦和快速恢复。 ImportanTLY，成功的注入将导致管理代理的全球交付。这个协议是适当的递送病毒载体，药物制剂或细胞对新生小鼠。

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研究方案

在协议中列出的所有程序已经批准学院为美​​国俄亥俄州立大学动物使用及护理委员会（IACUC）。

1.准备工作区

1. 收集湿冰麻醉的小鼠幼仔，​​一个空的保持架，以分隔从垫料，在解剖显微镜，其可被定位成一定角度喷射（使用光源以90°的光源坝 角向注射部位掩盖了静脉），清洁表面放置动物的注射，棉签，3/10毫升的胰岛素注射器用3/8"为30G针（每动物1）和1％伊文思蓝染料（与用于训练的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中）的溶液制成。
2. 删除大坝到一个单独的笼子，而操控幼崽。

2.注射过程

1. 直接将单小狗在湿冰30-60秒，以麻醉的动物。不要离开吨他的动物冰上过长因体温过低相关并发症，包括心室颤动，组织缺氧和代谢性酸中毒的风险。
   注:我们的经验是30-60秒，足以减缓小狗的动作，让注射。如果更深麻醉需要，吸入剂，如1-2％异氟醚可以是合适的。
2. 而动物是冰，装入注射器30微升的伊文思蓝染料。
3. 当动物被完全麻醉，通过在仍呼吸冰缺乏运动的确认后，将它在显微镜下。为右旋注入，面对动物的枪口右侧。将左手的食指上枪口和左手的中指尾椎到耳芽，使耳芽是食指和中指（ 图1）之间。
4. 检查只是前耳芽的浅表毛细血管的运动时，皮肤被操纵。该毛细管是不是目标，但是识别是颞静脉识别非常重要。接下来，找到一个黑暗，朦胧的静脉不如保持不变，无论皮肤位置的毛细血管。颞静脉出现神出鬼没，运行背侧到腹侧，并馈入颈静脉（ 图1）。
5. 输入与针头斜面向上颞静脉。如果正确地插入时，也能够查看针头斜面充满血液通过皮肤。然后压下柱塞慢慢地和音符静脉向下的面一侧的热烫。
6. 允许针留在静脉内用于增加10-15秒，以防止注入剂的回流。

3.后喷射

1. 正确的注射后，小狗应立即变成蓝色。取下针头和使用轻柔的力向棉棒适用于注射部位直到血块。
2. 监控小狗遇险的迹象。让小狗2-3分钟，以恢复和复温河ecognize当小狗是有意识的，正直和移动，久违的笼子前。世界杯研究者的戴手套的手幼仔提供适当的保暖，如果有必要，以帮助恢复。或者，将笼下一个加热垫，以方便升温注入小狗。一般的伊文思蓝染料注射后，安乐死幼仔。注射试验材料时，不要包括染料。
3. 将小狗放回笼子，确保小狗涂有被褥和/或nestlet确保reacceptance由大坝。
4. 使用新的注射器和棉棒每个小狗保持无菌。

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结果

在适当的注射，静脉应暂时关闭清楚，或者焯烫。如果注射染料整个小狗应该在几秒钟内变成蓝色。如果发生了不正确的喷射，往往有一个浓缩皮下推注的头部或颈部和注入剂可能泄漏的注射部位的出。不当注射剂也可能会导致围绕喉部青紫的外观。接收皮下注射（ 即注射液没有充分的静脉交付），一般遇到任何不良副作用和常规响应处理的正常小鼠注射做幼仔。

根?...

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讨论

血管内递送药物到中枢神经系统或整个身体难以在疾病的新生鼠模型。所描述的协议，是静脉内给药溶液加入到新生小鼠以最小的设备要求一种快速，相对非侵入性的方式。虽然颞面部静脉可以通过肉眼观察，注射液可以具有更高的准确性与使用显微镜和光纤光源的，特别是对于一个不熟练的喷射器。在新生小鼠的血管内注射剂具有较高的成功率^12，和AAV转导已经在早幼崽被观察到即使注...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope