Las inyecciones intravenosas en ratones recién nacidos

Resumen

Los modelos animales de enfermedad pediátrica pueden experimentar aparición temprana y progresión de la enfermedad agresiva. Clínicamente entrega terapia pertinente a jóvenes modelos de ratón puede ser técnicamente difícil. Este protocolo describe un método de inyección intravenosa no invasivo para ratones recién nacidos dentro de los dos primeros días después del parto de la vida.

Resumen

La inyección intravenosa es una forma clínicamente aplicable para entregar agentes terapéuticos. Para roedores adultos y los animales más grandes, las inyecciones intravenosas son técnicamente viables y la rutina. Sin embargo, algunos modelos de ratones puede tener la aparición temprana de la enfermedad con una progresión rápida que hace que la administración de terapias potenciales difícil. La vena temporal (o facial) está justo anterior a la brote del oído en ratones y es claramente visible durante los dos primeros días después del nacimiento a cada lado de la cabeza utilizando un microscopio de disección. Durante esta ventana, la vena temporal puede ser inyectado con volúmenes de hasta 50 l. La inyección es segura y bien tolerada tanto por los cachorros y las presas. Un procedimiento de inyección típico se completa en 1-2 min, después de lo cual el cachorro es devuelto a la jaula de alojamiento. Al tercer día después del parto la vena es difícil de visualizar y el procedimiento de inyección se convierte técnicamente confiables. Esta técnica se ha utilizado para la entrega de virus adeno-asociado (AAV) vectORS, que a su vez pueden proporcionar casi en todo el cuerpo, la expresión transgénica estable para la vida del animal dependiendo del serotipo viral elegido.

Introducción

Entrega de la terapéutica en el sistema nervioso central (SNC) en modelos murinos de enfermedad pediátrica sigue siendo un reto. Los ratones que estados de enfermedad recién nacidos modelo son de tamaño insuficiente y el desarrollo inmaduro, y por lo tanto puede ser difícil de inyectar directamente en estructuras adecuadas en el SNC. Inyección intravascular de agentes terapéuticos es un método no invasivo, bien tolerado para entregar las células, fármacos, o vectores virales para todo el cuerpo, incluyendo el SNC y la retina ^{1-5 3,5-9.} Publicaciones anteriores describen temporal inyección en la vena cara usando un transiluminador ^10,11, sin un microscopio de disección ^11,12, o que requieren dos personas para inyectar ^10. La técnica de inyección descrito en este protocolo es ventajoso porque un solo individuo puede inyectar cachorros, y la fuente de luz para ver la vena temporal no está en contacto con el cachorro, eliminando la necesidad de cinta quirúrgica o la fijación de un cachorro a una superficie fijatal como un transiluminador ^11. Entrega de adeno-asociado vector viral serotipo 9 (AAV9) en ratones produce sólida expresión en neuronas y astrocitos en todo el cerebro y la médula espinal (Figura 1). Entrega intravascular de vectores virales en la vena facial temporal superficial se ha utilizado de forma fiable en diversos estudios en ratones recién nacidos para tratar el trastorno neuromuscular pediátrica la atrofia muscular espinal (SMA) ^2,4,13,14 y en última instancia el aumento de la vida útil de los ratones tratados.

Inyección intravascular de ratones neonatales también apunta eficazmente el sistema nervioso periférico y los órganos periféricos (Figura 2). Después de la inyección de AAV, la transducción de ganglios de la raíz dorsal, hígado, corazón, músculo esquelético, pulmón, y el plexo mientérico de la tripa se ha observado ^1,3,6,7,15. Transducción generalizada del sistema nervioso central y la periferia hace que este método de inyección ideal para enfermedades que requieren expresión global deun transgén, como la enfermedad ^{de 16} y otra de almacenamiento lisosomal enfermedades de Gaucher, la enfermedad de ^17,18 Batten y ceroid lipofuscinoses neuronales relacionados, ^{el 19} y el síndrome de Bardet-Biedl, un trastorno multisistémico genética con la aparición de los síntomas que se producen en la primera infancia ^20. Inyección intravascular en ratones neonatal también debe ser considerado como un nuevo método de enfermedades pediátricas de todo el sistema de modelado. Esta técnica ha sido traducida a los modelos animales más grandes ^5,21 y la inyección intravascular ya existe como un método clínicamente aceptable de la entrega de la terapéutica.

El actual protocolo describe un método simple y eficiente de suministro de agentes a ratones recién nacidos a través de la vena superficial cara temporal a más tardar el día postnatal 2. Inyección puede ser completado por una sola, practica individual y es bien tolerado por tanto las crías y las presas. Los cachorros experimentan angustia mínima y se recuperan rápidamente. Importantemente, la inyección exitosa resultará en la entrega global del agente administrado. Este protocolo es apropiado para la administración de vectores virales, agentes farmacéuticos o células a ratones recién nacidos.

Protocolo

Todos los procedimientos que figuran en el protocolo han sido aprobados Instituto de Uso de Animales y el comité de Atención (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio.

1. Preparación del espacio de trabajo

1. Reunir hielo húmedo para anestesiar a las crías de ratón, una jaula vacía para segregar la presa de la litera, un microscopio de disección, una fuente de luz que se puede colocar en un ángulo a la inyección (uso de una fuente de luz en un 90 °   ángulo con el sitio de la inyección oscurece la vena), una superficie limpia para colocar el animal para la inyección, hisopos de algodón, 3/10 cc jeringa de insulina con 3/8 "30 G aguja (uno por animal) y 1% de colorante azul de Evans ( hecho con tampón fosfato salino) solución (PBS) para la formación.
2. Retire la presa a una jaula separada, mientras que la manipulación de los cachorros.

Procedimiento 2. Inyección

1. Coloque una sola cría directamente en el hielo húmedo durante 30-60 segundos para anestesiar al animal. No deje tque los animales en el hielo demasiado tiempo debido a un riesgo de complicaciones relacionadas con la hipotermia, incluyendo la fibrilación ventricular, hipoxia tisular y acidosis metabólica.
   NOTA: Nuestra experiencia es que 30 a 60 segundos es suficiente para frenar los movimientos de las crías para permitir la inyección. Si se requiere anestesia más profunda, inhalantes tales como 1-2% de isoflurano pueden ser apropiados.
2. Mientras el animal está en el hielo, cargue la jeringa con 30 l de colorante azul de Evans.
3. Cuando el animal está completamente anestesiado, confirmado por la falta de movimiento en el hielo, mientras que todavía respiraba, moverse bajo el microscopio. Para una inyección diestro, enfrentar el hocico del animal a la derecha. Coloque el dedo índice izquierdo en el hocico y el caudal dedo medio izquierdo para el auricular para que el auricular está entre el índice y el dedo medio (Figura 1).
4. Examine justo anterior al brote del oído de un capilar superficial que se mueve cuando la piel se manipula. Este capilar no es el objetivo, sin embargoidentificación es importante para la identificación de la vena temporal. A continuación, busque un sombrío vena oscura inferior al capilar que permanece fijo independientemente de la posición de la piel. La vena temporal parece sombrío, corre dorsal a ventral, y se alimenta en la vena yugular (Figura 1).
5. Introduzca la vena temporal con la aguja de bisel hacia arriba. Si se inserta correctamente, es posible ver el bisel de la aguja se llenan de sangre a través de la piel. Luego presione el émbolo lenta y la nota de escaldado de la vena por el lado de la cara.
6. Deje que la aguja permanezca dentro de la vena por un 10-15 seg añadido para evitar el reflujo de la inyectante.

3. Post-inyección

1. Después de una inyección adecuada, el cachorro debe ponerse azul casi de inmediato. Retire la aguja y el uso de fuerza suave para aplicar un hisopo de algodón para el sitio de inyección hasta que los coágulos de sangre.
2. Monitorear el cachorro en busca de signos de angustia. Deje que el cachorro 2-3 minutos para recuperarse y se vuelven a calentar, reconocer cuando el cachorro está consciente, de pie y en movimiento, antes de regresar a la jaula. Copa de las crías en las manos enguantadas del investigador para proporcionar calidez apropiada para ayudar en la recuperación si es necesario. Como alternativa, coloque una almohadilla eléctrica bajo la jaula para facilitar el calentamiento del cachorro inyectado. Generalmente después de una inyección de colorante azul de Evans, la eutanasia crías. No incluya tinte al inyectar el material de prueba.
3. Coloque el cachorro de nuevo en la jaula de alojamiento y asegúrese de que el cachorro se recubre con ropa de cama y / o nestlet para asegurar reaceptación por la represa.
4. Utilice una nueva jeringa y un hisopo de algodón para cada cachorro para mantener la esterilidad.

Resultados

Durante una inyección adecuada, la vena debe girar momentáneamente claro, o blanquear. Si la inyección de teñir todo el cachorro debe ponerse azul en cuestión de segundos. Si se ha producido una inyección inadecuada, a menudo hay un bolo subcutáneo concentrada en la cabeza o el cuello y inyectante puede salirse del sitio de inyección. Inyecciones inapropiadas también pueden dar lugar a la aparición de moretones alrededor de la garganta. Los cachorros que reciben inyecciones subcutáneas (es decir, la ...

Discusión

Entrega intravascular de agentes para el SNC o en todo el cuerpo es difícil en modelos murinos neonatales de la enfermedad. El protocolo descrito es una forma rápida, relativamente no invasiva para administrar por vía intravenosa soluciones en ratones recién nacidos con los requisitos mínimos de equipamiento. Aunque la vena cara temporal puede ser visto por el ojo desnudo, las inyecciones pueden tener una mayor precisión con el uso del microscopio y fuente de luz de fibra óptica, especialmente para un inyector si...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope