Intravenöse Injektionen in neugeborenen Mäusen

Zusammenfassung

Tiermodelle der pädiatrischen Erkrankung früh einsetzende und aggressiven Krankheitsprogression zu erleben. Klinisch relevante Therapieabgabe, junge Maus-Modellen kann technisch schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur intravenösen Injektion neugeborene Mäuse innerhalb der ersten zwei Tage nach der Geburt des Lebens.

Zusammenfassung

Die intravenöse Injektion ist eine klinisch anwendbare Weise Therapeutika liefern. Für erwachsene Nager und größere Tiere, sind intravenöse Injektionen technisch möglich und Routine. Jedoch können einige Mausmodellen frühen Ausbruch der Krankheit mit einem schnellen Fortschreiten, die Verabreichung von potentiellen Therapien schwierig macht. Die zeitliche (oder Gesichts) Vene nur an das Ohr Knospe anterioren bei Mäusen und ist eindeutig für die ersten zwei Tage nach der Geburt sichtbar auf beiden Seiten des Kopfes mit einem Binokular. Während diesem Fenster können die zeitliche Vene mit einem Volumen von bis zu 50 & mgr; l injiziert werden. Die Injektion ist sicher und gut durch sowohl den Welpen und der Muttertiere vertragen. Eine typische Injektionsverfahren wird innerhalb von 1-2 min, wonach der Welpe ist mit dem Heimkäfig zurück abgeschlossen. Mit dem dritten Tag nach der Geburt die Vene ist schwierig zu visualisieren und das Einspritzverfahren wird technisch unzuverlässig. Diese Technik ist für die Lieferung von Adeno-assoziierten Virus (AAV) vect verwendetors, die wiederum fast körper breit, stabile Transgenexpression für das Leben des Tieres in Abhängigkeit von dem viralen Serotyp ausgewählt ist.

Einleitung

Lieferung von Therapeutika auf das zentrale Nervensystem (ZNS) in Mausmodellen der pädiatrische Erkrankung bleibt eine Herausforderung. Mäuse, die Modell Neugeborenen Krankheitszustände sind unterdimensioniert und entwicklungs unreif, und kann daher schwer direkt in geeignete Strukturen im ZNS zu injizieren. Intravaskuläre Injektion von therapeutischen Mitteln ist eine nicht-invasive, gut verträgliche Methode, um Zellen, Drogen oder viralen Vektoren an den gesamten Körper einschließlich des CNS ^1-5 und Retina ^3,5-9 liefern. Zurück Publikationen beschreiben zeitliche Gesicht Veneninjektion mit einem Transilluminator ^10,11, ohne Dissektionsmikroskop ^11,12 oder zwei Individuen erfordern spritzen ^10. Die Injektionstechnik in diesem Protokoll beschrieben ist vorteilhaft, weil eine einzelne Person kann Welpen zu injizieren, und die Lichtquelle zu sehen die zeitliche Vene den Welpen nicht zu berühren, wodurch die Notwendigkeit für chirurgische Band oder das Anbringen eines Welpen auf eine feste Oberflächewie einem Transilluminator ^11. Lieferung von Adeno-assoziierten viralen Vektor Serotyp 9 (AAV9) in Mäusen erzeugt robuste Expression in Neuronen und Astrozyten im Gehirn und Rückenmark (Abbildung 1). Intravaskuläre Lieferung von viralen Vektoren in die temporalis superficialis V. facialis wurde zuverlässig in verschiedenen Studien in neugeborenen Mäusen verwendet, um die pädiatrische neuromuskuläre Erkrankung Spinale Muskelatrophie (SMA) ^2,4,13,14 behandeln und letztlich erhöhte die Lebensdauer der behandelten Mäuse.

Intravaskuläre Injektion von neugeborenen Mäusen auch effektiv zielt auf das periphere Nervensystem und peripheren Organen (Abbildung 2). Nach Injektion von AAV hat Transduktion von Spinalganglien, Leber, Herz, Skelettmuskel, Lunge und Plexus myentericus des Darms beobachtet ^1,3,6,7,15. Verbreitete Transduktion des ZNS und Peripherie macht dieses Verfahren ideal für Injektionskrankheiten globalen Expression erforderlichein Transgen, wie Morbus Gaucher ¹⁶ und andere lysosomale Speicherkrankheiten ^17,18, Batten-Krankheit und verwandte neuronale Zeroidlipofuszinosen, ¹⁹ und Bardet-Biedl-Syndrom, einer genetischen Multisystemerkrankung mit Beginn der Symptome in der frühen Kindheit ²⁰ auftritt. Intravaskulärer Injektion in neugeborenen Mäusen sollte auch als ein neuartiges Verfahren zur Modellierung systemweite pädiatrische Erkrankungen angesehen werden. Diese Technik hat den großen Tiermodellen ^5,21 übersetzt und intravaskuläre Injektion als eine klinisch akzeptable Methode der Bereitstellung von Therapeutika ist bereits vorhanden.

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine einfache, effiziente Methode der Bereitstellung von Mitteln, um neugeborenen Mäusen durch die temporalis superficialis Gesicht Vene spätestens postnatalen Tag 2. Injektion kann durch eine einzige abgeschlossen werden, praktiziert einzelnen und ist gut von den beiden Jungtieren und die Dämme toleriert. Pups erleben minimal Not und erholen sich schnell. Importantly werden erfolgreiche Injektion in globalen Auslieferung des verabreichten Mittels führen. Dieses Protokoll ist für die Lieferung von viralen Vektoren, pharmazeutische Mittel oder Zellen neugeborener Mäuse geeignet.

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Protokoll

Alle im Protokoll aufgeführten Verfahren genehmigt worden Institut für Tier Benutzung und Pflege Ausschuss (IACUC) der Ohio State University.

1. Herstellung von Workspace

1. Gather nassem Eis, um die Maus Welpen zu betäuben, einen leeren Käfig, um den Damm aus dem Wurf, einem Binokular, einer Lichtquelle, die in einem Winkel zu der Injektion (Verwendung einer Lichtquelle mit einer 90 ° positioniert werden kann trennen   Winkel zu der Injektionsstelle verdeckt die Vene), eine saubere Oberfläche, um das Tier für die Einspritzung, Wattestäbchen, 3/10 cc-Insulinspritze mit 3/8 "30 G-Nadel (eines pro Tier) und 1% Evans Blue-Farbstoff ( mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS)) Lösung für die Ausbildung gemacht.
2. Entfernen Sie die Staumauer in einen separaten Käfig, während die Manipulation der Welpen.

2. Injektionsverfahren

1. Legen Sie eine einzelne Welpe direkt auf dem nassen Eis für 30-60 sec, um das Tier zu betäuben. Lassen Sie keine ter Tier auf Eis zu lange wegen einer Gefahr der Unterkühlung im Zusammenhang mit Komplikationen einschließlich Kammerflimmern, Gewebehypoxie und metabolische Azidose.
   HINWEIS: Unsere Erfahrung ist, dass 30 bis 60 sec ist ausreichend, um die Welpen Bewegungen verlangsamen, um die Injektion zu ermöglichen. Wenn tiefer Narkose erforderlich ist, kann Inhalationsmittel, wie 1-2% Isofluran geeignet.
2. Während das Tier auf dem Eis, laden Sie die Spritze mit 30 ul Evans blauen Farbstoff.
3. Wenn das Tier vollständig betäubt wird, durch den Mangel an Bewegung auf dem Eis, während noch atmete bestätigt, verschieben Sie sie unter dem Mikroskop. Für einen rechtshändigen Injektion gegen Schnauze des Tieres nach rechts. Platzieren Sie den linken Zeigefinger auf die Schnauze und dem linken Mittelfinger kaudal der Ohrhörer, so dass der Ohrhörer ist zwischen dem Zeige- und Mittelfinger (Abbildung 1).
4. Untersuchen nur der vordere Ohrstöpsel für eine oberflächliche Kapillare, wenn die Haut Stell bewegt. Diese Kapillare ist nicht das Ziel, aberIdentifikation ist wichtig für zeitliche Venenerkennung. Als nächstes suchen Sie einen dunklen, schattenhaften Venen schlechter als die Kapillare, die unabhängig von Haut Position fixiert bleibt. Die zeitliche Vene erscheint schemen läuft dorsal nach ventral und mündet in die Halsschlagader (Abbildung 1).
5. Geben Sie den zeitlichen Vene mit der Nadel Kegel up. Wenn richtig eingesetzt, ist es möglich, sehen die Nadelkegel mit Blut zu füllen durch die Haut. Dann den Kolben langsam drücken und Mitteilungsblanc der Vene an der Seite des Gesichts.
6. Dass die Nadel in der Vene für eine zusätzliche 10-15 sec, um eine Rückströmung der Einspritzmittel zu verhindern bleibt.

3. Post-Injektion

1. Nach einer korrekten Injektion sollte der Welpe blau fast sofort einzuschalten. Entfernen Sie die Nadel und benutzen sanfter Gewalt zu einem Wattestäbchen auf die Injektionsstelle, bis die Blutgerinnsel gelten.
2. Überwachen Sie den Welpen für Anzeichen von Leiden. Lassen Sie den Welpen 2-3 min zu erholen und aufwärmen, recognize wenn der Welpe bei Bewusstsein ist, aufrecht und bewegt, vor der Rückkehr in den Käfig. Cup die Welpen in behandschuhten Händen des Untersuchers, angemessene Wärme in der Erholung bei Bedarf Hilfe zu leisten. Alternativ legen Sie ein Heizkissen unter dem Käfig zu erleichtern Erwärmung des eingespritzten pup. In der Regel nach einem Evans blauen Farbstoff Injektion, einschläfern Welpen. Enthalten Farbstoff nicht bei der Injektion Testmaterial.
3. Platzieren Sie den Welpen wieder in den Heimkäfig und sicherstellen, der Welpe ist mit Bettwäsche und / oder nestlet beschichtet, um Wiederaufnahme durch den Damm zu sichern.
4. Verwenden Sie eine neue Spritze und Wattestäbchen für jeden Welpen, um die Sterilität zu erhalten.

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Ergebnisse

Während einer richtigen Injektion sollte die Vene vorübergehend drehen klar oder blanchieren. Wenn Injizieren färben die gesamte pup sollte blau innerhalb von Sekunden zu drehen. Wenn eine fehlerhafte Einspritzung stattgefunden hat, gibt es oft eine konzentrierte subkutaner Bolus in den Kopf oder Nacken und Injektionsmittel kann aus der Injektionsstelle zu lecken. Unsachgemäße Injektionen können auch im Erscheinungsbild des Blutergüsse um den Hals führen. Pups, die subkutane Injektionen erhalten (dh die...

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Diskussion

Intravaskuläre Abgabe von Mitteln an das ZNS oder im ganzen Körper ist schwer in neonatalen Mausmodellen von Krankheiten. Das beschriebene Protokoll ist eine schnelle, relativ nicht-invasive Weise, intravenös verabreichen Lösungen in neugeborenen Mäusen mit minimalen Anforderungen an die Ausrüstung. Wenn die zeitliche Fläche Vene mit dem bloßen Auge gesehen werden kann, können Injektionen größere Genauigkeit unter Verwendung des Mikroskops und faseroptische Lichtquelle, vor allem für einen ungeübten Injekto...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope