Внутривенных инъекций в новорожденных мышей

Резюме

Животные модели детской болезни могут испытать раннее возникновение и прогрессирование агрессивное заболевание. Клинически значимые доставка терапия для молодых мышах может быть технически сложно. Этот протокол описывает неинвазивный внутривенного метод впрыска для новорожденных мышей в течение первых двух послеродовых дней жизни.

Аннотация

Внутривенная инъекция является клинически применимо манера доставить терапевтические. Для взрослых грызунов и более крупных животных, внутривенные инъекции, технически осуществимо и рутина. Тем не менее, некоторые модели мышей могут иметь раннее начало заболевания с быстрым прогрессированием, что делает администрация потенциальных методов лечения трудно. Временной (или лица) вена просто передней к ушным вкладышем на мышах и отчетливо видна в течение первых двух дней после родов по обе стороны от головки с использованием рассекает микроскопом. В течение этого окна, временная вены может быть введен с объемами до 50 мкл. Инъекция является безопасным и хорошо переносится как детенышей и плотин. Типичная процедура инъекции завершается в течение 1-2 мин, после чего щенок возвращается к домашней клетке. К третьему день после рождения жила трудно представить себе и процедура инъекции становится технически ненадежны. Эта техника была использована для доставки вируса аденоассоциированный (AAV) VectПРС, что в свою очередь может обеспечить почти тела шириной, стабильную экспрессию трансгена для жизни животного в зависимости от вирусной серотипа выбранной.

Введение

Доставка терапевтических до центральной нервной системы (ЦНС) в мышиных моделях инфекции у детей остается проблемой. Мыши, которые модели новорожденных болезненных состояний являются низкорослыми, а с развитием незрелыми, и, следовательно, может быть трудно вводить непосредственно в соответствующих структур в ЦНС. Внутрисосудистого введения терапевтических агентов является неинвазивным, хорошо переносится метод доставить клетки, наркотики, или вирусные векторы для всего тела, включая ЦНС ^1-5 и сетчатки ^3,5-9. Предыдущие публикации описывают временную инъекции лицо вен с помощью просвечивания ^10,11, без микроскопом рассечение ^11,12, или требующих двух лиц, чтобы ввести ^10. Техника инъекции описано в данном протоколе выгодно, потому что один человек может придать щенков, и источник света, чтобы просмотреть временная вена не касаясь щенка, устраняя необходимость в хирургической кассете или прикрепление щенка к неподвижной поверхноститакие как просвечивания ^11. Доставка аденоассоциированного вирусный вектор серотипа 9 (AAV9) у мышей производит сильную экспрессию в нейронах и астроцитов всему головного и спинного мозга (рис 1). Внутрисосудистого доставка вирусных векторов в поверхностной височной лица вены была надежно использоваться в различных исследованиях в неонатальном мышей лечить педиатрической нервно-мышечной расстройства Спинальная мышечная атрофия (СМА) ^2,4,13,14 и в конечном счете увеличивается продолжительность жизни мышей.

Внутрисосудистого введения новорожденных мышей также эффективно нацелен на периферическую нервную систему и периферические органы (рис 2). После инъекции AAV, трансдукция ганглиях задних корешков, печени, сердца, скелетной мышце, легких, мышечной оболочки кишечника и сплетения кишечника наблюдалось ^1,3,6,7,15. Широкое трансдукция ЦНС и на периферии делает этот метод впрыска идеала для заболеваний, требующих глобального выражениетрансген, таких как болезни ¹⁶ и другие хранилища лизосомальных болезней Гоше ^17,18, болезни Баттена и связанных с ними нейронов цероид lipofuscinoses, ¹⁹ и синдромом Барде-Biedl, генетическое заболевание мультисистемной с момента появления симптомов, возникающих в раннем детстве ^20. Внутрисосудистого введения в неонатальном мышей также следует рассматривать в качестве нового метода общесистемных моделирования педиатрических заболеваний. Эта техника была переведена на более крупных животных моделях ^5,21 и внутрисосудистой инъекции уже существует в виде клинически приемлемый метод доставки терапевтических.

Текущий протокол описывает простой, эффективный метод не доставки агентов на новорожденных мышах через поверхностной височной лица вены не позднее послеродовой день 2. Инъекции могут быть укомплектованы одной, практикуется индивидуальный и хорошо переносится как детенышей и плотин. Щенки испытывать минимальное бедствие и быстро восстанавливаться. ImportanTLY, успешно впрыска приведет к глобальной доставки средства, вводимого. Этот протокол является подходящим для доставки вирусных векторов, фармацевтических агентов или клеток, к новорожденных мышей.

протокол

Все процедуры, перечисленные в протоколе были утверждены институт животноводства пользования и комитета Уход (IACUC) из Университета штата Огайо.

1. Подготовка рабочего пространства

1. Соберите мокрый лед, чтобы обезболить щенков мыши, пустую клетку, чтобы отделить плотину из помета, вскрытии микроскопом, источника света, который может быть расположен под углом к ​​инъекции (использование источника света на 90 °   Угол в месте инъекции затеняет вены), чистую поверхность, чтобы поместить животное для инъекций, ватные тампоны, 3/10 куб.см инсулиновый шприц с 3/8 "30 G иглы (по одному на животных) и 1% синий краситель Эванса ( сделаны с фосфатным буферным солевым раствором (PBS)) раствор для обучения.
2. Снимите дамбу в отдельную клетку, манипулируя при щенков.

Процедура 2. Инъекции

1. Поместите один щенок прямо на льду в течение 30-60 сек обезболить животное. Не оставляйте тон животное на льду слишком долго из-за риска переохлаждения осложнений, включая фибрилляции желудочков, тканевой гипоксии и метаболического ацидоза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наш опыт показывает, что 30-60 сек достаточно, чтобы замедлить движение щенок, чтобы для инъекций. Если глубже анестезия не требуется, ингаляции, такие как 1-2% изофлуран может быть целесообразно.
2. В то время как животное на льду, загрузить шприц с 30 мкл Эванса синего красителя.
3. Когда животное полностью под наркозом, подтверждается отсутствием движения на льду в то время как все еще дышит, переместите его под микроскопом. Для правосторонней инъекции, сталкиваются морду животного вправо. Поставьте левую указательный палец на морде и левого среднего пальца каудально ушным вкладышем так что ухо бутон между указательным и средним пальцами (рис 1).
4. Изучить только впереди ушной зародыше для поверхностного капилляра, что движется, когда кожа манипулируют. Это капиллярной не является целью, однакоидентификация является важным для временной идентификации вен. Затем найдите темный, смутный вену, ниже капилляра, что остается фиксированной, независимо от положения кожи. Временная вены появляется призрачная, работает от спины к брюху, и каналы в яремную вену (рис 1).
5. Введите временной вену с иглы конической вверх. Если правильно установлен, его можно просмотреть игла коническая наполняются кровью через кожу. Затем нажмите на поршень медленно и примечание побледнение вену вниз в сторону лица.
6. Разрешить игла остается в вене для дополнительного 10-15 сек для предотвращения обратного потока инъекционной.

3. После инъекции

1. После правильного введения, щенок должен почти сразу синеют. Удалите иглу и нежный силу не применять ватный тампон, чтобы в месте инъекции, пока тромбов.
2. Монитор щенка на наличие признаков бедствия. Разрешить щенок 2-3 мин, чтобы восстановить и отогреть, гecognize когда щенок находится в сознании, в вертикальном положении и перемещения, прежде чем вернуться в клетку. Кубок щенки в перчатках следователя предоставить соответствующую тепло, чтобы помочь в восстановлении, если это необходимо. Кроме того, место грелку под дом клетке для облегчения прогрева введенного щенка. Вообще после инъекции голубого красителя Эванса, усыпить щенков. Не включать краситель при введении исследуемого материала.
3. Поставьте щенка обратно в дом клетке и обеспечить щенок покрыт постельными принадлежностями и / или nestlet обеспечить обратный прием по плотине.
4. Используйте новый шприц и ватный тампон для каждого щенка для поддержания стерильности.

Результаты

Во время правильного инъекции, вены должны на короткое время становится ясным, или бланшировать. Если инъекционных красить весь щенок должен синеть в течение нескольких секунд. Если неправильная инъекция произошла, часто есть концентрированное подкожной болюсной в голову или шею и ин...

Обсуждение

Внутрисосудистого поставка агентов в ЦНС или по всему телу трудно в неонатальных мышиных моделях болезни. Описанный протокол является быстрым, относительно неинвазивным способом внутривенно вводить растворы в неонатальном мышей с минимальными требованиями к оборудованию. Хотя врем...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope