신생아 마우스의 정맥 주사

요약

소아 질환의 동물 모델은 초기 발병과 적극적인 질병의 진행을 경험할 수 있습니다. 임상 어린 마우스 모델에 관련된 치료 전달 기술적 어려울 수있다. 이 프로토콜은 생후 두 생후 일 이내 신생 쥐 비 침습적 정맥 주입 방법을 설명한다.

초록

정맥 주사는 치료제를 제공하기 위해 임상 적으로 적용 가능한 방법이다. 성인 설치류 큰 동물의 경우, 정맥 주사는 기술적으로 가능하고 일상이다. 그러나 일부 마우스 모델은 잠재적 인 치료의 관리가 어려워 빠른 진행과 질병의 조기 발병을 가질 수 있습니다. 시간 (또는 안면) 정맥은 마우스에서 이어 버드에 전방 및 해부 현미경을 사용하여 머리의 어느 한쪽에 생후 명확 처음 이틀 동안 표시된다. 이 윈도우 동안, 시간적 정맥 50 μl의 최대 양으로 주입 될 수있다. 주사는 안전하고 잘 새끼와 어미 모두 허용합니다. 전형적인 주입 과정은 강아지가 홈 케이지로 복귀 된 후 1-2 분 이내에 완료된다. 제 생후함으로써 정맥 시각화 어렵고 주입 과정은 기술적으로 불안정해진다. 이 기술은 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) VECT의 전달을 위해 사용되어왔다차례로 선택한 바이러스 혈청 형에 따라 동물의 수명을 거의 몸 전체, 안정적인 형질 전환 유전자 발현을 제공 할 수 있습니다 ORS.

서문

소아 질병의 쥐 모델에서 중추 신경계 (CNS)에 대한 치료제의 배달는 도전 할 부분이 남아있다. 모델 신생아 질병 상태를 직접 CNS 내에서 적절한 구조에 삽입하기 어려울 수 있으므로 소형 및 발달 미숙 한 것을 마우스. 치료제의 혈관 내 주입 CNS ^{1-5과 3,5-9} 망막을 포함한 몸 전체에 세포, 약물, 또는 바이러스 벡터를 제공 할 수있는 비 침습적, 내약성 방법이다. 이전 출판물은 해부 현미경 ^{11, 12} 않고, transilluminator가 ^{10, 11을} 사용하여 시간적 얼굴 정맥 주입을 설명, 또는 두 사람을 요구하는 것은 ^(10)를 삽입 할 수 있습니다. 한 개인이 새끼를 주입 할 수 있으며, 광원은 시간적 정맥이 강아지를 만지고 고정 표면 외과 테이프의 필요성 또는 강아지의 부착을 제거하지 않은 볼 때문에 프로토콜에서 설명 주입 기술은 유리한transilluminator가 ¹¹ 등. 마우스에 아데노 - 관련 바이러스 벡터 혈청 형 9 (AAV9)의 전달은 뇌와 척수 (그림 1)를 통해 신경 세포와 성상 세포에 강력한 표현을 생성합니다. 피상적 시간적 안면 정맥 내로 바이러스 벡터의 전달을 확실하게 혈관 신경 근육 질환 소아 척수 근육 위축 (SMA) ^2,4,13,14을 치료하는 신생아 마우스에서 다양한 연구에 사용 된 궁극적으로 처리 된 마우스의 수명을 증가되었다.

신생아 쥐의 혈관 내 주입도 효과적으로 말초 신경계 및 말초 기관 (그림 2)을 대상으로합니다. AAV의 주입 후, 후근 신경절, 간, 심장, 골격근, 폐, 그리고 창자의 myenteric 신경 얼기의 전달은 ^{1,3,6,7,15을} 관찰되었다. CNS와 주변의 대폭적인 전달은 글로벌 표현을 필요로하는 질병에 대한 분사 이상이 방법을 만든다이러한 고셔병 ⁽¹⁶⁾ 및 기타 리소좀 저장 질환 ^{17, 18,} ​​판자의 질병과 관련된 신경 ceroid lipofuscinoses, ¹⁹ Bardet-Biedl 증후군, 유아 ^(20)에서 발생하는 증상의 발병에 유전 적 다중 시스템 장애로 형질 전환 유전자,. 혈관 신생 생쥐에 주입은 모델링 시스템 전체 소아 질환의 신규 한 방법으로 고려되어야한다. 이 기술은 큰 동물 모델 ^5,21로 번역 한 내용 및 혈관 내 주입 이미 치료제를 전달 임상 적으로 허용되는 방법으로 존재한다.

현재의 프로토콜은 출생 후 하루 2 사출 늦어도 피상적 인 시간적 얼굴 정맥을 통해 신생아 쥐에 에이전트를 도출하는 간단하고 효율적인 방법을 설명하는 하나의 완성 할 수있다, 개인 연습을 잘 새끼와 어미 모두 허용됩니다. 새끼 최소한의 고통을 경험하고 신속하게 복구 할 수 있습니다. ImportanTLY, 성공적인 주입은 관리 에이전트의 글로벌 배달 될 것입니다. 이 프로토콜은 바이러스 벡터, 신생아 쥐에 제약 제제 또는 세포의 전달에 적합하다.

프로토콜

프로토콜에 나열된 모든 절차는 오하이오 주립 대학의 동물 사용 및 관리위원회 (IACUC) 연구소 승인되었습니다.

작업 1. 준비

1. 깔짚, 해부 현미경, 90 °로 주사 (광원의 사용 각도로 위치 될 수 광원으로부터 댐을 분리하는, 빈 케이지 마우스 새끼 마취 젖은 얼음 수집   주사 부위에 각도는 정맥), 주사에 대한 동물을 배치 깨끗한 표면, 면봉, 3/8 "30 G 바늘 (동물 당), 1 % 에반스 블루 염료 3/10 CC 인슐린 주사기 (가린다 교육을위한 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)) 솔루션을했다.
2. 새끼를 조작하면서 별도의 케이지에 댐을 제거합니다.

2. 사출 절차

1. 동물을 마취하는 30 ~ 60 초 동안 얼음물에 직접 하나의 강아지를 놓습니다. t 방치하지 마십시오인해 심실 세동, 조직의 저산소증과 대사성 산증을 포함하여 저체온증과 관련된 합병증의 위험에 너무 오래 얼음에 그는 동물.
   참고 : 우리의 경험은 30 ~ 60 초 분사를 허용하는 강아지의 움직임을 느리게하기에 충분하다는 것이다. 깊은 마취가 요구되는 경우, 예컨대 1 ~ 2 %의 이소 플루 란과 같은 흡입제가 적절할 수있다.
2. 동물이 얼음에 있지만, 에반스 블루 염료의 30 μL와 주사기를로드합니다.
3. 동물이 완전히 마취되면, 여전히 호흡하는 동안 얼음에 운동 부족에 의해 확인 현미경으로 이동합니다. 오른손 주입 들어, 오른쪽으로 동물의 총구에 직면한다. 이어 버드는 색인과 중간 손가락 (그림 1) 사이가되도록 이어 버드에 총구와 왼쪽 가운데 손가락 꼬리에 왼쪽 검지 손가락을 놓습니다.
4. 단지 피부가 조작 될 때 이동하는 표면 모세 혈관의 이어 버드로 전방 검사합니다. 이 모세관하지만, 대상이 아니다식별은 시간 정맥 식별을 위해 중요하다. 다음에 관계없이 피부의 위치에 고정되어 모세관 열등 어두운 그림자가 정맥을 찾습니다. 시간 정맥, 그림자가 나타납니다 지느러미에 복부 실행하고, 경정맥 (그림 1)에 공급한다.
5. 바늘 베벨 위로 시간적 정맥을 입력합니다. 올바르게 삽입하면 바늘 베벨 피부를 통해 혈액으로 채워 볼 수있다. 그런 다음 천천히 플런저를 우울하게하고 노트는 얼굴의 측면 아래 정맥의 창백.
6. 바늘이 주입 물 역류를 방지하기 위해 첨가 10-15 초 동안 정맥 내 유지하도록 허용.

3. 주입 후

1. 적절한 주입 한 후, 강아지는 거의 즉시 파란색 설정해야합니다. 바늘을 제거하고 혈액 응고 될 때까지 주사 부위에 면봉을 적용하는 부드러운 힘을 사용합니다.
2. 고통의 흔적이 강아지를 모니터링합니다. 강아지 2 ~ 3 분 복구하고 rewarm 허용, R강아지가 케이지에 반환하기 전에, 의식 수직 및 이동 때 ecognize. 컵 탐정의 장갑을 낀 손에 새끼 필요한 경우 복구에 도움이되는 적절한 온기를 제공합니다. 선택적으로, 주입 된 새끼 온난화 촉진하는 홈 케이지 하에서 가열 패드를 배치. 일반적으로 에반스 블루 염료를 주입 한 후, 새끼를 안락사. 시험 물질을 주입 할 때 염료를 포함하지 마십시오.
3. 다시 홈 케이지에 강아지를 놓고 강아지가 댐에 의해 reacceptance을 보장하기 위해 침구 및 / 또는 nestlet로 코팅되어 있는지 확인합니다.
4. 불임을 유지하기 위해 각각의 강아지에 대한 새 주사기와 면봉을 사용합니다.

결과

적절한 주입하는 동안, 정맥은 순간적으로 분명, 또는 희게을 설정해야합니다. 염료 주입하면 전체 강아지 초 ​​이내에 파란색 설정해야합니다. 부적절한 분사가 발생한 경우, 종종 주사 부위 밖으로 누출 될 머리 또는 목 주입 물에서 농축 피하 볼 러스있다. 부적절한 주사는 또한 목 주위에 멍이의 모양이 발생할 수 있습니다. (분사가 완전히 정맥에 배달되지 않은 IE) 일반적으로 더 아?...

토론

CNS 또는 몸 전체 에이전트의 혈관 배달 질환의 신생아 쥐 모델에서 어렵다. 설명 프로토콜은 정맥 최소한의 장비 요구 사항에 신생아 쥐에 솔루션을 관리 할 수​​있는 빠르고, 비교적 비 침습적 방법입니다. 시간적 얼굴 정맥을 육안으로 볼 수 있지만, 주사는 특히 unpracticed 인젝터, 현미경 및 광섬유 광원의 사용과 높은 정확도를 가질 수있다. 신생아 마우스에서 혈관 내 주사는 높은 성공률

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope