Le iniezioni per via endovenosa nel topo neonatale

Riepilogo

Modelli animali di malattia pediatrica possono sperimentare insorgenza precoce e la progressione della malattia aggressiva. Erogazione di una terapia clinicamente rilevanti per modelli giovani del mouse può essere tecnicamente difficile. Questo protocollo descrive un metodo di iniezione endovenosa non invasivo per topi neonati entro i primi due giorni di vita postnatale.

Abstract

L'iniezione endovenosa è un modo clinicamente applicabile per fornire terapie. Per i roditori adulti e animali più grandi, iniezioni endovenose sono tecnicamente fattibili e di routine. Tuttavia, alcuni modelli di mouse possono avere insorgenza precoce della malattia, con una progressione rapida che rende la somministrazione di potenziali terapie difficile. La vena temporale (o facciale) è appena anteriore alla auricolare nei topi ed è chiaramente visibile per i primi due giorni dopo la nascita su entrambi i lati della testa utilizzando un microscopio da dissezione. In questa finestra, la vena temporale può essere iniettato con volumi fino a 50 microlitri. L'iniezione è sicuro e ben tollerato sia dai cuccioli e le dighe. Una tipica procedura di iniezione è completata entro 1-2 minuti, dopo di che il cucciolo viene restituito alla gabbia a casa. Con il terzo giorno dopo la nascita la vena è difficile da visualizzare e la procedura di iniezione diventa tecnicamente inaffidabile. Questa tecnica è stata utilizzata per la consegna del virus adeno-associato (AAV) vectRUP, che a loro volta possono fornire, espressione del transgene stabile quasi scala corpo per la vita dell'animale a seconda del sierotipo virale prescelto.

Introduzione

Consegna di terapie del sistema nervoso centrale (SNC) in modelli murini di malattia pediatrica rimane una sfida. I topi che modello patologie neonatali sono sottodimensionati e in maniera immatura, e quindi può essere difficile da iniettare direttamente in strutture adeguate all'interno del sistema nervoso centrale. Iniezione intravascolare di agenti terapeutici è un non-invasiva, metodo ben tollerato per fornire cellule, droghe, o vettori virali per tutto il corpo, compreso il sistema nervoso centrale e della retina ^{1-5 3,5-9.} Pubblicazioni precedenti descrivono temporale iniezione faccia vena utilizzando un transilluminatore ^10,11, senza un microscopio dissezione ^11,12, o che richiedono due individui a iniettare ^10. La tecnica di iniezione descritto in questo protocollo è vantaggioso perché un singolo individuo può iniettare cuccioli, e la sorgente di luce per visualizzare la vena temporale non tocca il cucciolo, eliminando la necessità di nastro chirurgico o l'attacco di un cucciolo di una superficie fissacome un transilluminatore ^11. Consegna di adeno-associato vettore virale sierotipo 9 (AAV9) nei topi produce robusta espressione nei neuroni e astrociti in tutto il cervello e il midollo spinale (Figura 1). Consegna intravascolare di vettori virali nella superficiale vena facciale temporale è stato utilizzato in modo affidabile in vari studi in topi neonati per trattare il disturbo neuromuscolare pediatrica Atrofia Muscolare Spinale (SMA) ^2,4,13,14 e, infine, ha aumentato la durata della vita dei topi trattati.

Iniezione intravascolare di topi neonati anche gli obiettivi in modo efficace il sistema nervoso periferico e organi periferici (Figura 2). Dopo l'iniezione di AAV, trasduzione dei gangli spinali, fegato, cuore, muscolo scheletrico, del polmone e del plesso mioenterico dell'intestino è stato osservato ^1,3,6,7,15. Trasduzione diffusa del SNC e della periferia rende questo metodo di iniezione ideale per le malattie che richiedono espressione globaleun transgene, come la malattia di ¹⁶ e di altre malattie da accumulo lisosomiale di Gaucher ^17,18, la malattia di Batten e relativi lipofuscinoses ceroid neuronali, ¹⁹ e la sindrome di Bardet-Biedl, una malattia multisistemica genetico con insorgenza dei sintomi che si verificano nella prima infanzia ^20. Iniezione intravascolare in topi neonatale dovrebbe essere considerato come un nuovo metodo di malattie pediatriche modellazione a livello di sistema. Questa tecnica è stato tradotto in modelli animali di maggiori dimensioni ^5,21 e l'iniezione intravascolare esiste già come un metodo clinicamente accettabile di fornire terapie.

L'attuale protocollo descrive un metodo semplice e efficace di diffondere agenti a topi neonati attraverso il volto superficiale vena temporale entro e non oltre postnatale giorno 2. iniezione può essere completato da un singolo, praticata individuale ed è ben tollerato sia dai cuccioli e le dighe. Pups sperimentano disagio minimo e recuperare rapidamente. ImportanTLY, iniezione di successo si tradurrà nella consegna globale dell'agente somministrato. Questo protocollo è appropriato per la consegna di vettori virali, agenti farmaceutici o cellule di topi appena nati.

Protocollo

Tutte le procedure elencate nel protocollo sono stati approvati Istituto per uso animale e del comitato Care (IACUC), della Ohio State University.

1. Preparazione del lavoro

1. Raccogliere ghiaccio, per anestetizzare i cuccioli di topo, una gabbia vuota per separare diga dalla lettiera, un microscopio da dissezione, una fonte di luce che può essere posizionato in un angolo per l'iniezione (uso di una sorgente di luce a 90 °   angolo rispetto al sito di iniezione oscura la vena), una superficie pulita per posizionare l'animale per l'iniezione, tamponi di cotone, 3/10 cc siringa da insulina con 3/8 "30 ago G (uno per animale) e l'1% Evans Blu Dye ( fatta con) una soluzione tampone fosfato salino (PBS) per la formazione.
2. Rimuovere la diga di una gabbia separata, mentre la manipolazione dei cuccioli.

Procedura 2. Iniezione

1. Posizionare un cucciolo direttamente sul ghiaccio umido per 30-60 secondi per anestetizzare l'animale. Non lasciare tegli animali sul ghiaccio troppo a lungo a causa di un rischio di complicanze legate ipotermia, tra cui la fibrillazione ventricolare, ipossia tissutale e acidosi metabolica.
   NOTA: La nostra esperienza è che 30-60 secondi è sufficiente a rallentare i movimenti cucciolo per consentire l'iniezione. Se è necessaria l'anestesia profonda, inalanti, come 1-2% isoflurano può essere opportuno.
2. Mentre l'animale è sul ghiaccio, caricare la siringa con 30 ml di Evans colorante blu.
3. Quando l'animale è completamente anestetizzato, confermata dalla mancanza di movimento sul ghiaccio mentre ancora respirando, spostarlo al microscopio. Per un'iniezione mano destra, di fronte il muso dell'animale a destra. Posizionare il dito indice sinistro sul muso e la caudale dito medio sinistro per il cuscinetto auricolare in modo che il cuscinetto auricolare è tra l'indice e il medio (Figura 1).
4. Esaminare solo anteriore per il cuscinetto auricolare per una capillare superficiale che si muove quando la pelle viene manipolato. Questa capillare non è l'obiettivo, maidentificazione è importante per l'identificazione della vena temporale. Quindi, individuare un buio, vena ombra inferiore alla capillare che rimane fissa a prescindere dalla posizione della pelle. La vena temporale appare in ombra, corre dorsale a ventrale, e alimenta la vena giugulare (Figura 1).
5. Inserisci la vena temporale con l'ago smusso up. Se inserita correttamente, è possibile visualizzare le bisello dell'ago riempiono di sangue attraverso la pelle. Quindi premere il pistone lentamente e nota pallore della vena lungo il lato del viso.
6. Lasciare l'ago di rimanere all'interno della vena per l'aggiunta di un 10-15 secondi per impedire il riflusso del injectant.

3. Post-iniezione

1. Dopo un'iniezione adeguata, il cucciolo dovrebbe diventare blu quasi immediatamente. Rimuovere l'ago e usare la forza gentile per applicare un tampone di cotone sul sito di iniezione fino a quando i coaguli di sangue.
2. Monitorare il cucciolo per segni di sofferenza. Lasciare il cucciolo 2-3 minuti per recuperare e riscaldare, recognize quando il cucciolo è cosciente, in posizione verticale e in movimento, prima di tornare in gabbia. Coppa dei cuccioli nelle mani guantate del ricercatore di fornire calore appropriato per aiutare nel recupero, se necessario. In alternativa, inserire una piastra elettrica sotto la gabbia a casa per facilitare il riscaldamento il cucciolo iniettato. In genere dopo l'iniezione colorante blu Evans, eutanasia cuccioli. Non includere colorante quando si inietta materiale di prova.
3. Posizionare il cucciolo nella gabbia casa e garantire il cucciolo è rivestito con biancheria da letto e / o nestlet per garantire il reinserimento dalla diga.
4. Utilizzare una nuova siringa e un batuffolo di cotone per ogni cucciolo di mantenere la sterilità.

Risultati

Durante una iniezione corretta, la vena deve momentaneamente girare chiaro, o sbollentare. Se l'iniezione di tingere l'intero cucciolo dovrebbe diventare blu in pochi secondi. Se si è verificato un iniezione improprio, vi è spesso un bolo sottocutaneo concentrato nella testa o al collo e injectant può fuoriuscire dal sito di iniezione. Iniezioni scorrette possono anche provocare la comparsa di lividi intorno alla gola. Cuccioli che ricevono iniezioni sottocutanee (cioè l'iniezione non è stato c...

Discussione

Consegna intravascolare di agenti al sistema nervoso centrale o in tutto il corpo è difficile in modelli murini di malattie neonatali. Il protocollo descritto è un modo rapido, relativamente non invasivo per somministrare per via endovenosa di soluzioni in topi neonati con requisiti di equipaggiamento minimo. Sebbene faccia temporale vena può essere visto ad occhio nudo, iniezioni possono avere una maggiore precisione con l'uso del microscopio e sorgente di luce a fibre ottiche, in particolare per un iniettore in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope