Les injections intraveineuses de souriceaux nouveau-nés

Résumé

Les modèles animaux de la maladie pédiatrique peuvent éprouver précoce et la progression de la maladie agressive. Cliniquement l'administration du traitement pertinent de jeunes modèles de souris peut être techniquement difficile. Ce protocole décrit une méthode d'injection intraveineuse non-invasive pour les souris nouveau-nés dans les deux premiers jours après la naissance de la vie.

Résumé

L'injection intraveineuse est une manière cliniquement applicable à délivrer thérapeutique. Pour les rongeurs adultes et les grands animaux, des injections intraveineuses sont techniquement réalisables et routine. Toutefois, certains modèles de souris peuvent avoir l'apparition précoce de la maladie avec une progression rapide qui rend l'administration de thérapies potentielles difficile. La veine temporale (ou faciale) est juste en avant de l'oreille bourgeon chez la souris et est clairement visible pour les deux premiers jours après la naissance de chaque côté de la tête à l'aide d'un microscope à dissection. Au cours de cette fenêtre, la veine temporale peut être injecté avec des volumes allant jusqu'à 50 ul. L'injection est sûr et bien toléré par les deux petits et des barrages. Une procédure typique d'injection est achevé dans les 1-2 min, après quoi le chiot est renvoyée à la cage d'accueil. Le troisième jour après la naissance de la veine est difficile de visualiser et de la procédure d'injection devient techniquement fiables. Cette technique a été utilisée pour la livraison d'un virus adéno-associé (AAV) vectRUP, qui à son tour peut fournir, l'expression du transgène stable presque corps à l'échelle de la vie de l'animal en fonction du sérotype viral choisi.

Introduction

Livraison de médicaments pour le système nerveux central (SNC) dans des modèles murins de la maladie pédiatrique reste un défi. Les souris qui modèle états pathologiques nouveau-nés sont trop petits et des troubles de développement, et donc peut être difficile à injecter directement dans des structures appropriées au sein du CNS. Injection intravasculaire de produits thérapeutiques est une méthode bien toléré le non-invasive de produire des cellules, des médicaments ou des vecteurs viraux pour l'ensemble du corps, y compris le système nerveux central et de la rétine ^{1-5 3,5-9.} Publications antérieures décrivent injection visage de veine temporale en utilisant un transilluminateur ^10,11, sans un microscope de dissection ^11,12, ou nécessitant deux personnes à injecter ^10. La technique d'injection décrite dans le présent protocole est avantageuse car une seule personne peut injecter chiots, et la source de lumière pour voir la veine temporale ne touche pas le chiot, éliminant le besoin de ruban adhésif chirurgical ou la fixation d'un chiot à une surface fixecomme un transilluminateur ^11. Livraison de adéno-associé de sérotype 9 vecteur viral (AAV9) chez la souris produit une expression robuste dans les neurones et les astrocytes dans le cerveau et la moelle épinière (Figure 1). Livraison intravasculaire de vecteurs viraux dans la veine temporale superficielle du visage a été utilisé de manière fiable dans diverses études chez la souris néonatale pour traiter le trouble neuromusculaire pédiatrique amyotrophie spinale (SMA) ^2,4,13,14 et finalement augmenté la durée de vie des souris traitées.

L'injection intravasculaire de souris néonatales vise aussi efficacement le système nerveux périphérique et les organes périphériques (Figure 2). Après l'injection de l'AAV, la transduction des ganglions de la racine dorsale, le foie, le cœur, le muscle squelettique, du poumon et du plexus myentérique de l'intestin a été observé ^1,3,6,7,15. Transduction généralisée du SNC et la périphérie rend cette méthode d'idéal d'injection pour les maladies nécessitant une expression globale deun transgène, comme la maladie et ¹⁶ autres lysosomales les maladies de Gaucher ^17,18, la maladie de Batten et ceroid lipofuscinoses neuronales connexes, ¹⁹ et syndrome de Bardet-Biedl, une maladie génétique multisystémique avec apparition des symptômes qui se produisent dans la petite enfance ^20. L'injection intravasculaire dans des souris nouveau-né doit également être considérée comme une nouvelle méthode de maladies pédiatriques de l'ensemble du système de modélisation. Cette technique a été traduit en plus grands modèles animaux ^5,21 et injection intravasculaire existe déjà comme une méthode cliniquement acceptable de fournir des traitements.

Le protocole actuel décrit une méthode simple, efficace d'agents à des souris néonatales fournir par le superficiel visage temporelle veine plus tard postnatal jour 2. Injection peut être complété par un seul individu pratiqué et est bien toléré par les deux petits et des barrages. Les chiots de détresse est minime et se rétablissent rapidement. ImportanTLY, injection réussie se traduira par la livraison globale de l'agent administré. Ce protocole est approprié pour la livraison de vecteurs viraux, les agents pharmaceutiques ou des cellules à des souris nouveau-nés.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans le protocole ont été approuvés Institut pour l'utilisation des animaux et du Comité de protection (IACUC) de l'Université d'État de l'Ohio.

1. Préparation de l'espace de travail

1. Rassemblez glace humide pour anesthésier les souriceaux, une cage vide pour séparer le barrage de la litière, un microscope de dissection, une source de lumière qui peut être positionné à un angle à l'injection (utilisation d'une source lumineuse à un 90 °   angle au site d'injection obscurcit la veine), une surface propre à placer l'animal pour l'injection, des cotons-tiges, 3/10 cc seringue à insuline avec 3/8 "30 aiguille G (une par animal) et Evans à 1% de bleu de méthylène ( fait avec du tampon phosphate salin (PBS)) solution pour la formation.
2. Retirez le barrage à une cage séparée tout en manipulant les chiots.

2. Procédure d'injection

1. Placez un seul petit directement sur la glace humide pendant 30-60 secondes pour anesthésier l'animal. Ne laissez pas til animale sur la glace trop longtemps en raison d'un risque de complications liées à l'hypothermie, y compris une fibrillation ventriculaire, une hypoxie tissulaire et une acidose métabolique.
   NOTE: Notre expérience est que 30-60 sec est suffisant pour ralentir les mouvements de chiot pour permettre l'injection. Si une anesthésie profonde est nécessaire, des substances inhalées tels que 1-2% d'isoflurane peut être appropriée.
2. Alors que l'animal est sur la glace, charger la seringue avec 30 pi de colorant bleu Evans.
3. Lorsque l'animal est complètement anesthésié, confirmé par l'absence de mouvement sur la glace tout en respirant, le déplacer sous le microscope. Pour une injection droitier, face à museau de l'animal vers la droite. Placer l'index gauche sur le museau et la caudale médius gauche à l'œuf de l'oreille afin que le bourgeon oreille est entre l'index et le majeur (figure 1).
4. Examinez juste en avant de l'oreille bourgeon pour un capillaire superficiel qui se déplace lorsque la peau est manipulé. Ce capillaire est pas la cible, maisidentification est importante pour l'identification de veine temporale. Ensuite, localisez un endroit sombre, sombre veine inférieure au capillaire qui reste fixe indépendamment de la position de la peau. La veine temporale apparaît sombre, fonctionne dorsal à ventral, et se jette dans la veine jugulaire (figure 1).
5. Entrez le veine temporale avec l'aiguille biseau vers le haut. Si inséré correctement, il est possible de voir le biseau de l'aiguille se remplissent de sang à travers la peau. Puis appuyer sur le piston lentement et la note de blanchiment de la veine sur le côté du visage.
6. Laisser l'aiguille reste à l'intérieur de la veine pour une ajoutée 10-15 secondes pour empêcher le reflux de la solution injectée.

3. Post-injection

1. Après une injection proprement dite, le chiot doit virer au bleu presque immédiatement. Retirez l'aiguille et utiliser la force douce à appliquer un coton-tige pour le site d'injection jusqu'à ce que les caillots de sang.
2. Surveiller le chiot pour des signes de détresse. Laisser le chiot 2-3 min à récupérer et réchauffer, recognize lorsque le chiot est conscient, debout et en mouvement, avant de revenir à la cage. Coupe des chiots dans des mains gantées de l'enquêteur apporter de la chaleur approprié pour aider à la récupération si nécessaire. Sinon, placez un coussin chauffant sous la cage d'accueil pour faciliter le réchauffement du chiot injecté. Généralement après une injection de colorant bleu Evans, euthanasier les chiots. Ne pas inclure colorant lors de l'injection du matériel d'essai.
3. Placez le chiot dans la cage de la maison et assurer le chiot est recouvert d'une literie et / ou nestlet pour assurer réacceptation par le barrage.
4. Utilisez une nouvelle seringue et un coton-tige pour chaque chiot pour maintenir la stérilité.

Résultats

Lors d'une injection correcte, la veine doit momentanément tourner clair, ou blanchir. Si l'injection de colorant l'ensemble du chiot doit virer au bleu en quelques secondes. Si une injection incorrecte a eu lieu, il ya souvent un bolus sous-cutané concentré dans la tête ou du cou et injectant peut fuir du site d'injection. Injections inappropriées peuvent également entraîner l'apparition d'ecchymoses autour de la gorge. Les chiots qui reçoivent des injections sous-cutanées (par exem...

Discussion

Livraison intravasculaire de produits à la CSN ou dans tout le corps est difficile dans les modèles murins de la maladie néonatale. Le protocole décrit est un moyen rapide, relativement non invasive à administrer par voie intraveineuse à des souris nouveau-né solutions avec les besoins en équipement minimum. Bien que le visage veine temporale peut être vu par l'œil nu, les injections peuvent avoir une plus grande précision à l'aide du microscope et la source lumineuse à fibre optique, en particulier...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope