鼠表皮离体感染单纯疱疹病毒1型

摘要

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

摘要

进入其人类宿主，单纯疱疹病毒1型（HSV-1），必须克服的粘膜表面，皮肤或角膜的屏障。初始进入期间HSV-1的目标的角质，并建立在该上皮，之后是神经元的潜伏感染的主要感染。激活后，病毒可出现皮肤水泡或粘膜溃疡粘膜部位变得明显。如何HSV-1侵入皮肤或黏膜和达到其受体知之甚少。调查入侵路线的HSV-1的成表皮组织在细胞水平上，我们建立鼠表皮的离体感染模型，它代表的原发性和复发性感染中的皮肤的部位。该测定法包括鼠皮肤的制备。表皮从真皮层经分散酶II处理分离。浮动的表皮片含病毒的培养基上后，将组织是固定的，感染后可在不同的时间感染后由可视化用针对HSV-1的立即早期蛋白ICP0的抗体染色感染细胞。 ICP0表达细胞，可以在基底角质形成细胞层在1.5小时感染后观察到了。较长感染次，感染的细胞在基底层层检测，表明感染并不限定于基底角质形成细胞，但病毒扩散到其他的层中的组织。使用各种小鼠模型的表皮片，感染协议允许确定向HSV-1侵入到组织的细胞成分的参与。另外，该测定是合适的，以测试在组织抑制剂，与初始条目的步骤干扰，细胞至细胞的传播和病毒生产。在这里，我们详细描述的体外感染协议和使用的Nectin-1-或HVEM缺陷型小鼠呈现我们的结果。

引言

单纯疱疹病毒（HSV）可引起一系列疾病从轻度无并发症的皮肤粘膜损伤到危及生命的感染人类。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是显性与口面部感染和脑炎相关，而HSV 2型（HSV-2）更可能导致生殖器感染^1。虽然在了解HSV是如何进入细胞的培养，引发感染并产生病毒的后代显著的进步，我们知道一点关于病毒的入侵途径（S）进入组织细胞水平^2。单纯疱疹病毒的皮肤或粘膜感染，小鼠的研究，兔和豚鼠已用作动物模型。皮肤感染成立通过皮内注射或通过刮擦中病毒的存在的皮肤，和疾病发展率与病毒的产生。这些方法有助于理解疾病的发病机制的各个方面，并用于评估抗病毒药。研究HSV感染的Tissu酒店E级，人体器官皮肤模型已经应用。作为感染的速率被限制在这些筏培养，研究调查感染，病毒传播和抗病毒成分的影响仅有限数量的已出版^3-6。

为了表征细胞的决定因素，在HSV-1感染的完整上皮细胞发挥 ​​作用，我们建立了一个协议，用于小鼠表皮⁷的体外感染的研究。皮肤从新生儿或从成年小鼠的尾部制备。由于HSV-1能不感染完整的皮肤样本，它被淹没在含病毒的培养基中，我们通过分散酶II处理分离的真皮表皮。含病毒介质上浮动的表皮片材后，感染的细胞可以在不同的时间感染后（PI）的⁷被可视化的表皮基底层。现有可视感染个体细胞的启动病毒复制一第二病毒产生，我们用针对所述感染的细胞蛋白质0（ICP0），这是在HSV-1感染所表示的第一蛋白之一的抗体。 ICP0的细胞定位在早期感染穿过不同的阶段。而ICP0存在于核灶期间病毒基因表达的早期阶段，ICP0至细胞质的重新定位指示随后感染⁸的相位。

我们使用表皮片的体外感染测定从不同小鼠模型感染期间测试各种细胞因子的潜在作用。为了解决Rac1的作为肌动蛋白动力学的关键调节的影响，我们感染小鼠的表皮具有 ​​角化细胞特异性缺失RAC1基因^9。此模型使我们能够研究对HSV-1感染在表皮角化层中的效率缺陷的Rac1的后果。以对照同窝感染表皮重新比较vealed无显著差异，这表明不存在的Rac1的有感染在表皮⁷的基底层开始没有影响。使用进一步小鼠模型使我们能够解决该细胞受体介导进入表皮。从任一的Nectin-1-或HVEM缺陷小鼠用HSV-1感染表皮片显露最初的病毒进入组织强烈依赖的^Nectin-1 10的存在。此外，我们的结果表明，HVEM也可以有效地少充当受体在鼠表皮，虽然比的^Nectin-1 10。

为了解决感染的细胞中的表皮层的空间分布，我们想象在组织切片和表皮全样载（图1）ICP0表达。在完整皮肤的冷冻切片，没有ICP0表达细胞中检测到（ 图1）。与此相反，表皮片的冷冻切片表明细胞质ICP0表达在基底层已经3小时圆周率（ 图1）。在稍后时间，病毒扩散到基底层可以可视化。感染细胞在基底层的空间分布可以很容易地跟随在表皮全样载（ 图1）。在感染了HSV-1在100 PFU /细胞，在滤泡表皮的基底角质形成细胞的大约50％显示在1.5小时丕ICP0表达在这个时间点最感染的细胞表达核ICP0。 ICP0的再定位至细胞质指示早期基因表达的稍后阶段存在于几乎所有细胞在3小时圆周率（ 图1）。在体外 HSV-1感染的可视化感染细胞的这些模式提供了有力的实验来研究对病毒的进入和扩散在组织中删除/突变的细胞成分的抑制剂或效果。

研究方案

伦理声明。

表皮片从处死的动物的制备是严格按照Landesamt献给NATUR，UMWELT和Verbraucherschutz，北莱茵 - 威斯特法伦（德国）的指南的建议。该研究是通过LANUV NRW（编号8.84-02.05.20.13.018）。

1.准备仪器仪表及文化传媒

1. 培养表皮片在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/高葡萄糖含谷氨酰胺二肽，10％FCS，100IU / ml青霉素，和100μg/ ml链霉素（以下简称"DMEM"）。
2. 对表皮片的制备中，仔细地溶解分散酶II粉末（5毫克/毫升）中加热的PBS（高达37℃）。过滤通过0.22微米的过滤器将溶液直接将其用于治疗。
3. 对于表皮整体编制^机构 13，准备拦截的buff尔用0.5％奶粉，从冷水鱼皮和0.5％的Triton X-100的TBS 0.25％明胶。允许物质通过至少2小时温育该混合物在RT下在旋转混合器溶解。还在PBS制备0.2％吐温20洗涤缓冲液。为固定，制备3.4％和在PBS中的4％甲醛。
4. 用于冷冻切片的免疫染色，制备封闭缓冲液，用5％正常山羊血清和0.2％吐温20在PBS中。对于固定，准备0.5％甲醛的PBS。

从鼠皮2制备表皮片的

1. 从新生儿背部皮肤感染的研究表皮的制备
   1. 放置一个断头小鼠（出生后1至3天）成夹层菜和切断四肢和尾靠近躯干，以允许从完全躯干有效地除去皮肤的。在去除四肢，尽量保持切口尽可能小的直径。
   2. 修正了曲细镊子一躯干ND轻轻移动钝头剪刀皮肤下面从颅沿后尾鳍到皮肤从躯干分离。狭缝沿背部皮肤。
   3. 对于FACS分析，角质形成细胞或准备RNA的分离，用钳子固定的组织和钝头剪刀推下躯干的躯干剥离完整的皮肤。对于冰冻切片或整个坐骑的准备只拿个背部皮肤。
   4. 印章的背部皮肤，用手术刀为1-2枚约10×10毫米。把碎片在一个6孔板以〜1毫升无菌PBS中的一个孔中。确保真皮侧面的底部。
   5. 更换PBS 1.5毫升分散酶II（5毫克/毫升的PBS）和孵育在37℃或者30分钟（对于整个坐骑）或O / N在4℃。用PBS洗3次。轻轻地取出表皮为使用一个镊子来解决下面的真皮和其他钳解除表皮完整片。用双眼做这一步EAS年。转移表皮片成DMEM符合其对底部的基底的一面。立即感染实验使用的床单。
      注:使用从新生儿皮肤的表皮准备主要为FACS分析，角质形成细胞或准备RNA的隔离。由于其脆弱性，编制感染薄板的冰冻切片或整个坐骑不太适合。
2. 成人尾部皮肤感染研究表皮的制备
   1. 安乐死的小鼠在1至3个月的颈椎脱臼的年龄。取尾巴，而不是背部皮肤，因为在背面的长嵌入毛囊阻碍完好表皮片的分离。切断从处死小鼠的尾部，用手术刀切开纵向它。
   2. 剥去骨头的皮肤，用手术刀把它切成约5×5mm的碎片。竖起来4件于一体的，并在2.1.5所述继续进行孵化分散酶II
      注:使用成人泰l湿准备冰冻切片或整个坐骑。可替代地，以立即使用，尾部可以存储或在4℃下输送大约24小时，而不会失去显著感染效率。如果尾巴跟上至48小时，表皮片可以几乎不感染HSV-1。
3. 表皮用于FACS分析的解离
   注:检测通过FACS分析表面蛋白质的表达需要适当的细胞解离技术不损害细胞表面和所关心的蛋白。
   1. 孵育1.5毫升/孔的重组胰蛋白酶的基于细胞解离15分钟，室温溶液和15分钟，在37℃的新生表皮片在一个6孔板与基底侧。
   2. 通过加入3ml DMEM停止孵育。通过使用弯曲的细镊子轻轻移动表皮在6孔板使得角质得到溶解解离的角质形成细胞。收集细胞悬液，重复此步骤3次总是用新鲜的DMEM。
      注:此分离程序是合适的检测的Nectin-1角质形成细胞的表面上。
   3. 可替代地，孵育上无酶细胞解离溶液的表皮片（CDS）15分钟，在室温和15分钟，在37℃。孵育另外15分钟，在RT下轻轻冲洗掉角质吹打CDS上下。
   4. 收集细胞悬浮液，并使用新鲜的DMEM重复冲洗步骤3次。
      注:此分解适用于检测HVEM的表面表达。在CDS溶液的缺点是，更少的细胞解离比用重组胰蛋白酶的基于细胞解离溶液。除了感染表皮片用重组胰蛋白酶的基于细胞解离溶液的离解后表面表达，核或细胞质表达如ICP0表达可以通过FACS进行分析。
4. 表皮解离隔离角质形成细胞或前道RNA
   1. 放新生儿表皮片在一个6孔板与朝其含有1.5毫升/孔的重组胰蛋白酶的基于细胞解离溶液的培养皿底部的基底侧。孵育在室温30分钟。添加3 ml的DMEM中，并通过使用弯曲的细镊子轻轻移动的菜表皮角化细胞解离。
   2. 收集细胞悬浮液，并使用新鲜的DMEM重复此步骤3次。使用该细胞悬浮液中提取RNA或文化原代鼠角质形成细胞。

3.感染表皮片与HSV-1

1. 制备的HSV-1重量17株¹¹的溶液在不大于500微升DMEM中以下，由病毒溶液在其上表皮片是浮更换介质。这个时间点被定义为时间0 ^12。在一个24孔板的一个孔，在37℃下进行表皮片的感染。病毒滴度的计算是基于所估计的数细胞在每表皮片的基底层的（大约每5×5毫米片^2×10 5个细胞）。
2. 感染了HSV-1在约100噬斑形成单位（PFU）/细胞并更换含病毒介质由DMEM，在1小时圆周率
   注:如果从新生儿皮肤表皮片的，记住，张开始孵化过程中解离。

4.可视化感染的细胞

1. 表皮整体^机构 13
   1. 修复表皮片用3.4％的甲醛无论是2小时在室温或O / N在4℃。洗两次，用PBS和0.5％奶粉，从冷水鱼皮和0.5％的Triton X-100的TBS 1小时在室温¹⁴ 0.25％明胶阻塞。
   2. 孵育板O / N小鼠抗ICP0（单克隆抗体^11060）15稀释1:60在封闭缓冲液在室温下。以可视化的中间纤维网络中同时孵育兔多克隆抗鼠标角蛋白14（100纳克/毫升）。
   3. 期间4小时，在室温洗涤4〜5次，用PBS-0.2％吐温20。孵育O / N与AF488标记的抗小鼠IgG（1微克/毫升），AF555缀合的抗兔IgG（1微克/毫升），和DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基）（100纳克/毫升）在封闭缓冲液在室温下。
   4. 用PBS-0.2％Tween 20的4小时在室温洗。山表皮片与他们的标本幻灯片顶底侧，嵌入荧光封固剂，盖上盖玻片。
2. 表皮冷冻切片
   1. 成人表皮片材在室温下固定在PBS中的4％甲醛20分钟，洗涤2次，用PBS。在组织中嵌入固定片冷冻介质和冷冻在液氮中。切8-10微米的部分用冷冻切片机。
   2. 固定再次用在PBS中的0.5％甲醛在室温10分钟的部分中，洗涤2次，用PBS，用30分钟，在室温在PBS 5％正常山羊血清和0.2％吐温20块，然后染色60分钟以米乌斯抗ICP0（单克隆抗体^11060）15稀释1:60在封闭缓冲液，随后3次用封闭缓冲液洗涤。
   3. 然后用AF488标记的抗小鼠IgG（1微克/毫升）和DAPI（100毫微克/毫升）培养在封闭缓冲液在室温45分钟，洗3次。荧光封固剂嵌入部分，盖上盖玻片。

结果

该方法的挑战是，制备表皮片到其中HSV-1可以从基底层穿透。的关键步骤是从真皮的表皮由分散酶II处理，这取决于该小鼠品系，需要调整的分离。分散酶II的浓度的范围可以从2.5至5毫克/毫升，并孵育20至45分钟的时间。的中间丝蛋白的角蛋白14的染色很容易地允许预测所述基底表皮层是否可以感染或是否会显示出感染的细胞（图2）只有非常有限。理想的是，角蛋白14染色的表皮整体坐...

讨论

当从C57BL / 6成人皮肤的表皮片材被感染HSV-1在约100 PFU /细胞，我们观察到感染几乎所有细胞中的基底层中的滤泡表皮而较低的病毒剂量关联与少感染的细胞和较慢的感染的进展。在一般情况下，毛囊显示可变数目的感染的细胞;而大多数的相当小的角化细胞衬显影毛囊感染，成人毛囊仅实施发胚芽被完全感染。取决于如何平缓的表皮由分散酶II处理前进的分离，毛囊的部件会丢失。在大多数情况下?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus