Ex Vivo infection de murin épiderme avec le virus Herpes simplex de type 1

Résumé

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Résumé

Pour entrer dans son hôte humain, le type de virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1) doit surmonter la barrière de la muqueuse des surfaces, la peau ou cornée. HSV-1 cibles kératinocytes au cours de l'entrée initiale et établit une infection primaire dans l'épithélium, qui est suivie par une infection latente de neurones. Après la réactivation, les virus peuvent devenir évident dans les établissements cutanéo-muqueuses qui apparaissent sous forme de vésicules cutanées ou des ulcères des muqueuses. Comment HSV-1 envahit peau ou les muqueuses et atteint ses récepteurs est mal comprise. Pour enquêter sur la route d'invasion du HSV-1 dans le tissu épidermique au niveau cellulaire, nous avons établi un modèle ex vivo de l'infection de l'épiderme murins, qui représente le site de l'infection primaire et récurrent dans la peau. L'essai comprend la préparation de la peau de souris. L'épiderme est séparé du derme par traitement dispase II. Après flottant feuilles épidermiques sur un milieu contenant le virus, le tissu est fixe et l'infection peut être visualisée à différents moments après l'infection parla coloration des cellules infectées avec un anticorps contre le HSV-1 précoce immédiat de protéine ICP0. ICP0 cellules exprimant peut être observé dans la couche basale de kératinocytes déjà à 1,5 heures après l'infection. Avec de plus longs temps d'infection, les cellules infectées sont détectés dans les couches suprabasales, ce qui indique que l'infection ne se limite pas aux kératinocytes basaux, mais le virus se propage à d'autres couches dans le tissu. Utilisation de feuilles épidermiques de différents modèles de souris, le protocole d'infection permet de déterminer l'implication des constituants cellulaires qui contribuent à l'invasion de HSV-1 dans le tissu. En outre, le dosage est adapté pour tester des inhibiteurs dans les tissus qui interfèrent avec les étapes initiales d'entrée, la propagation de cellule à cellule et la production de virus. Ici, nous décrivons l'ex vivo protocole d'infection en détail et présentons nos résultats en utilisant des souris de Nectin-1- ou HVEM déficient.

Introduction

Herpes simplex virus (HSV) peut provoquer une série de maladies chez l'homme des lésions cutanéo-muqueuses de simples doux aux infections mortelles. HSV de type 1 (HSV-1) est dominante associée à des infections oro-faciales et l'encéphalite, tandis que le HSV de type 2 (HSV-2) provoque plus susceptibles infections génitales ^1. Bien qu'il y ait des progrès significatifs dans la compréhension comment HSV pénètre dans les cellules en culture, déclenche l'infection et produit descendance virale, nous savons peu de choses sur la voie d'invasion virale (s) dans les tissus au niveau cellulaire ^2. Pour les études de HSV peau ou des infections des muqueuses, les souris, les lapins et les cochons d'Inde ont été utilisés comme modèles animaux. Infection de la peau a été établie par une injection intradermique ou par grattage de la peau en la présence du virus, et développement de la maladie a été corrélée avec la production de virus. Ces méthodes ont permis de comprendre les différents aspects de la pathogenèse de la maladie, et sont utilisés pour évaluer les médicaments antiviraux. Pour étudier l'infection HSV au tissue niveau, les modèles organotypiques de peau humaine ont été appliquées. Comme le taux d'infection est limité dans ces cultures en radeau, seul un nombre limité d'études portant sur ​​l'infection, la propagation virale et les effets des composants antiviraux ont été publiées ^3-6.

Afin de caractériser les déterminants cellulaires qui jouent un rôle lors de HSV-1 infection dans l'épithélium intact, nous avons établi un protocole pour les ex vivo des études d'infection de l'épiderme murins ^7. Peau été préparé à partir des nouveau-nés ou des queues de souris adultes. Depuis HSV-1 n'a pas pu infecter des échantillons de peau qui ont été effectués, dans un milieu submergées contenant le virus, nous avons séparé l'épiderme du derme par la dispase II traitement. Après flottant des feuilles épidermiques sur un milieu contenant le virus, les cellules infectées peuvent être visualisés dans la couche épidermique de base à différents moments après l'infection (pi) ^7. Pour visualiser le début de l'infection dans des cellules individuelles avant une réplication viralend production de virus, nous avons coloré avec un anticorps dirigé contre la protéine de cellule infectée 0 (ICP0), qui est l'une des premières protéines exprimées au cours de l'infection par HSV-1. La localisation cellulaire de ICP0 passe par des phases distinctes lors d'une infection précoce. Bien que ICP0 est présent dans des foyers nucléaires pendant un stade précoce de l'expression virale de gènes, de relocalisation ICP0 vers le cytoplasme indique une phase ultérieure de l'infection ^8.

Nous avons utilisé le test infection ex vivo de feuilles épidermiques à partir de différents modèles de souris pour tester le rôle potentiel de divers facteurs cellulaires lors de l'infection. Pour faire face à l'impact de Rac1 comme un régulateur clé de la dynamique de l'actine, nous avons infecté des souris de l'épiderme avec une deletion spécifique de kératinocyte du gène ⁹ Rac1. Ce modèle nous a permis d'étudier les conséquences de Rac1 déficiente sur l'efficacité du HSV-1 chez les couches de kératinocytes épidermiques. La comparaison de l'épiderme infectées de la même portée de contrôle rémis au jour de pas de différence significative, ce qui indique que l'absence de Rac1 n'a eu aucun effet sur ​​l'initiation de l'infection dans la couche basale de l'épiderme ^7. L'utilisation de modèles supplémentaires de souris nous a permis d'aborder des récepteurs cellulaires qui médiatisent l'entrée dans l'épiderme. Infecter les feuilles épidermiques à partir de soit nectin-1 ou des souris déficientes en HVEM avec HSV-1 a révélé que la première entrée du virus dans les tissus dépend fortement de la présence d'une ^10-nectine. De plus, nos résultats démontrent que HVEM peut également servir de récepteur dans l'épiderme de souris, bien que moins efficacement que nectin-1 ^10.

Pour répondre à la répartition spatiale des cellules infectées dans les couches épidermiques, on visualise de ICP0 expression dans des coupes de tissus épidermiques et montures entières (figure 1). Dans cryocoupes de peau complet, pas de cellules exprimant ICP0 sont détectés (figure 1). En revanche, les cryosections de feuilles épidermiques démontrent cytoplasmiqueICP0 expression dans la couche basale déjà à trois heures pi (Figure 1). Au temps plus tard, la propagation virale à suprabasale couches peuvent être visualisés. La répartition spatiale des cellules infectées dans la couche basale peut être facilement suivie dans épidermiques montures entières (Figure 1). Lors de l'infection par le HSV-1 à 100 PFU / cellule, environ 50% des kératinocytes basales de l'épiderme interfolliculaires montrer expression ICP0 à 1,5 h pi A ce point de temps la plupart des cellules infectées expriment ICP0 nucléaire. La relocalisation de ICP0 vers le cytoplasme indiquant un stade ultérieur de l'expression du gène précoce est présente dans presque toutes les cellules à 3 h pi (Figure 1). Ces modes de visualisation de cellules infectées ex vivo sur HSV-1 infection fournissent un test puissant pour étudier l'effet des inhibiteurs ou des composants cellulaires mutées supprimés / sur l'entrée virale et la propagation dans le tissu.

Protocole

Déclaration éthique.

La préparation de feuilles épidermiques à partir d'animaux sacrifiés est effectuée en stricte conformité avec les recommandations du Guide de Landesamt für Natur, Umwelt et Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie (Allemagne). L'étude a été approuvée par LANUV NRW (Nombre 8.84-02.05.20.13.018).

1. Préparation d'instruments et Culture Media

1. Cultiver feuilles épidermiques dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / glucose élevé dipeptide contenant de la glutamine, 10% de FCS, 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine (ci-après dénommé "DMEM").
2. Pour la préparation de feuilles épidermiques, dissoudre soigneusement dispase II poudre (5 mg / ml) dans du PBS chauffé (jusqu'à 37 ° C). Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um et l'utiliser directement pour le traitement.
3. Pour la préparation de l'épiderme tout montures ^13, préparer blocage chamoiser avec du lait en poudre 0,5%, 0,25% de gélatine à partir de peau de poisson d'eau froide et de 0,5% de Triton X-100 dans du TBS. Permettre aux substances à dissoudre par l'incubation du mélange pendant au moins 2 heures à température ambiante sur un mélangeur rotatif. Préparer également 0,2% de Tween 20 dans du PBS comme tampon de lavage. Pour la fixation, la préparation de 3,4% et 4% de formaldehyde dans du PBS.
4. Pour l'immunocoloration de cryosections, préparer le tampon de blocage avec 5% de sérum de chèvre normal et 0,2% de Tween 20 dans du PBS. Pour la fixation, préparer 0,5% de formaldéhyde dans du PBS.

2. Préparation des feuilles de épidermiques de la peau murine

1. Préparation de l'épiderme de la peau du nouveau-né de retour pour des études d'infection
   1. Placez une souris décapitée (1 à 3 jours après la naissance) dans un plat de dissection et couper les extrémités et la queue près du torse pour permettre une élimination efficace de la peau du torse complet. Lors de la dépose des extrémités, essayez de garder les coupes aussi faible que possible de diamètre.
   2. Fixer le torse avec une pince fine une courbend déplacez doucement ciseaux à embout arrondi sous la peau du crâne caudal le long du dos de séparer la peau du torse. Fendez la peau le long du dos.
   3. Pour l'analyse FACS, l'isolement des kératinocytes ou la préparation de l'ARN, décoller la peau complète du torse en utilisant une pince pour fixer le tissu et les ciseaux à embout arrondi pour pousser le torse. Pour la préparation de cryocoupes ou montures entières ne prendre que des morceaux de la peau du dos.
   4. Hacher la peau du dos avec un scalpel dans 1-2 pièces d'environ 10 x 10 mm. Mettez les morceaux dans un puits d'une plaque à 6 puits avec ~ 1 ml de PBS stérile. Assurez-vous que le côté dermique face au fond.
   5. Remplacer PBS par 1,5 ml dispase II (5 mg / ml de PBS) et incuber pendant soit 30 min à 37 ° C (pour les montages entiers) ou O / N à 4 ° C. Laver 3 fois avec du PBS. Retirez délicatement l'épiderme comme une feuille intacte en utilisant une pince pour fixer les derme sous-jacent et les autres pince pour soulever l'épiderme. Utilisez une paire de jumelles pour faire de cette étape EASy. Transférer la feuille épidermique dans du DMEM avec sa face basale vers le bas. Utilisez les feuilles immédiatement pour des expériences d'infection.
      REMARQUE: Utilisez la préparation de l'épiderme de la peau du nouveau-né principalement pour l'analyse FACS, l'isolement des kératinocytes ou la préparation de l'ARN. En raison de sa fragilité, la préparation de feuilles infectées pour cryocoupes ou montures entières est moins approprié.
2. Préparation de l'épiderme de la peau adulte de queue pour des études d'infection
   1. Euthanasier les souris à l'âge de 1 à 3 mois par dislocation cervicale. Prenez la queue à la place de la peau en arrière depuis les follicules pileux à long embarqués sur le dos entravent séparation des feuilles épidermiques intactes. Coupez la queue de souris sacrifiées et fente en longueur avec un scalpel.
   2. Décoller la peau de l'os et le hacher avec un scalpel en morceaux d'environ 5 x 5 mm. Mettez jusqu'à 4 pièces dans un puits et procéder à l'incubation dans dispase II tel que décrit à la section 2.1.5
      REMARQUE: Utilisez tai adultel peau pour préparer cryocoupes ou montures entières. Alternativement à l'utilisation immédiate, les queues peuvent être stockés ou transportés pendant environ 24 heures à 4 ° C sans perte d'efficacité de l'infection importante. Si les queues sont tenus à 48 h, feuilles épidermiques pourraient difficilement être infectées par le HSV-1.
3. La dissociation de l'épiderme pour une analyse FACS
   REMARQUE: La détection de l'expression de protéine de surface par analyse FACS nécessite des techniques de dissociation de cellules appropriées qui ne nuisent pas à la surface de la cellule et la protéine d'intérêt.
   1. Incuber feuilles épidermiques nouveau-nés dans une plaque à 6 puits avec la partie basale de 1,5 ml / solution de dissociation cellulaire bien recombinant basé trypsine pendant 15 min à température ambiante et pendant 15 minutes à 37 ° C.
   2. Arrêtez l'incubation en ajoutant 3 ml de DMEM. Dissocier les kératinocytes en utilisant une pince fine courbes se déplacer doucement l'épiderme dans la plaque de 6 puits de sorte que les kératinocytes se dissout. Recueillir la suspension cellulaire et répétez cette étape 3 foisen utilisant toujours DMEM frais.
      Remarque: Cette procédure de dissociation est approprié pour détecter nectin-1 sur la surface des kératinocytes.
   3. En variante, incuber les feuilles épidermiques sur une solution de dissociation cellulaire sans enzyme (CDS) pendant 15 min à la température ambiante et 15 min à 37 ° C. Incuber un autre 15 minutes à température ambiante pour rincer délicatement les kératinocytes par pipetage CDS haut et en bas.
   4. Recueillir la suspension cellulaire et répétez l'étape de rinçage 3 fois avec des ingrédients frais DMEM.
      REMARQUE: Cette dissociation est adapté pour détecter l'expression de surface de HVEM. L'inconvénient de la solution de la CDS est que moins de cellules sont dissociées avec une solution de dissociation cellulaire basé trypsine recombinante. En plus de l'expression de surface, l'expression cytoplasmique ou nucléaire telle que ICP0 expression peut être analysée par FACS après dissociation des feuilles infectées avec épidermiques solution de dissociation cellulaire à base de trypsine recombinante.
4. La dissociation de l'épiderme pour isoler les kératinocytes ou exARN tractus
   1. Mettre feuilles épidermiques nouveau-nés dans une plaque à 6 puits avec la face basale vers le fond de la boîte qui contient de 1,5 ml / solution de dissociation cellulaire à base de trypsine et recombinant. Incuber pendant 30 min à température ambiante. Ajouter 3 ml de DMEM et de dissocier les kératinocytes en utilisant une pince fine courbes se déplacer doucement l'épiderme dans le plat.
   2. Recueillir la suspension cellulaire et répétez cette étape 3 fois avec des ingrédients frais DMEM. Utiliser cette suspension de cellules à extraire l'ARN ou à la culture des kératinocytes primaires murins.

3. L'infection des feuilles épidermiques avec HSV-1

1. Préparer une solution de souche HSV-1 17 en poids de ¹¹ à au moins 500 ul de DMEM et remplacer le milieu par la solution de virus à laquelle les feuilles épidermiques sont flottantes. Ce point de temps est défini comme le temps 0 ^12. Effectuer l'infection d'une feuille épidermique dans un puits d'une plaque de 24 puits à 37 ° C. Le calcul du titre de virus est basé sur le nombre estiméde cellules dans la couche basale de l'épiderme par feuille (environ 2 x 10 ⁵ cellules par feuille 5 x 5 mm).
2. Infect avec HSV-1 à environ 100 unités formant des plages (PFU) / cellule et remplacer le milieu contenant le virus par du milieu DMEM à 1 h pi
   NOTE: En cas de feuilles épidermiques de la peau du nouveau-né, gardez à l'esprit que les feuilles commencent à se dissocier pendant l'incubation.

4. Visualisation des cellules infectées

1. Épidermique entier Mounts ¹³
   1. Fixer feuilles épidermiques avec 3,4% de formaldéhyde, soit pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. Laver deux fois avec du PBS et bloquer avec du lait en poudre 0,5%, 0,25% de gélatine à partir de peau de poisson d'eau froide et de 0,5% de Triton X-100 dans du TBS pendant 1 heure à température ambiante ^14.
   2. Incuber les feuilles O / N avec la souris anti-ICP0 (anticorps monoclonal 11060) ¹⁵ dilué 1:60 dans un tampon de blocage à la température ambiante. Pour visualiser le réseau de filaments intermédiaires incuber simultanément avec polyclonaux de lapin anti-kératine souris 14 (100 ng / ml).
   3. Laver 4 à 5 fois avec du PBS-0,2% de Tween 20 pendant 4 heures à température ambiante. Incuber O / N avec AF488 conjugué anti-IgG de souris (1 ug / ml), anti-IgG de lapin de AF555-conjugué (1 ug / ml), et le DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) (100 ng / ml) dans du tampon de blocage à température ambiante.
   4. Laver avec du PBS-0,2% de Tween 20 pendant 4 heures à température ambiante. Monter épidermiques feuilles avec leur côté basale sur une lame d'échantillon, intégrer dans un milieu de montage fluorescent et couvrent avec des lamelles.
2. Épidermique cryosections
   1. Feuilles épidermiques adultes ont été fixées dans du formaldehyde à 4% dans du PBS pendant 20 min à température ambiante et on les lave 2 fois avec du PBS. Feuilles fixes Intégrer dans le tissu milieu de congélation et de gel dans de l'azote liquide. Couper 8-10 um sections avec un cryomicrotome.
   2. Fixer les sections à nouveau avec 0,5% de formaldehyde dans du PBS pendant 10 min à température ambiante, laver 2 fois avec du PBS, bloc avec 5% de sérum de chèvre normal et 0,2% de Tween 20 dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, puis la coloration pendant 60 min avec mouse anti-ICP0 (anticorps monoclonal 11060) ¹⁵ dilué 1:60 dans du tampon de blocage, puis 3 fois avec le tampon de lavage de blocage.
   3. Puis incuber avec AF488 conjugué IgG anti-souris (1 pg / ml) et DAPI (100 ng / ml) dans du tampon de blocage pendant 45 min à température ambiante et laver 3 fois. Incluez sections en milieu de montage fluorescent et couvrir avec des lamelles.

Résultats

La difficulté de la méthode consiste à préparer des feuilles épidermiques dans lequel HSV-1 peut pénétrer à partir de la couche basale. L'étape critique est la séparation de l'épiderme du derme par traitement dispase II, qui, en fonction de la souche de souris, doit être adaptée. La concentration de dispase II peut varier de 2,5 à 5 mg / ml, et le temps d'incubation de 20 à 45 min. La coloration du filament intermédiaire protéines de kératine 14 permet facilement prédire si la couche basal...

Discussion

Lorsque des feuilles épidermiques de la peau des adultes à partir de souris C57BL / 6 sont infectées par le HSV-1 à environ 100 PFU / cellule, on observe infection dans presque toutes les cellules de la couche basale de l'épiderme interfolliculaire tandis que des doses de virus plus bas en corrélation avec les cellules moins infectée, et une plus lente progression de l'infection. En général, les follicules pileux présentent un nombre variable de cellules infectées; alors que la plupart des petits plut...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus