Ex Vivo infezione di Murine epidermide con Herpes Simplex Virus di tipo 1

Riepilogo

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Abstract

Per inserire il suo ospite umano, il tipo di virus herpes simplex 1 (HSV-1) deve superare la barriera della mucosa superfici, pelle, o cornea. HSV-1 obiettivi cheratinociti durante l'inserimento iniziale e stabilisce una infezione primaria nell'epitelio, che è seguita da infezione latente di neuroni. Dopo la riattivazione, i virus possono diventare evidente a siti mucocutanee che appaiono come vescicole cutanee o ulcere della mucosa. Come HSV-1 invade la pelle o le mucose e raggiunge i suoi recettori è poco conosciuta. Per studiare il percorso invasione HSV-1 nel tessuto epidermico a livello cellulare, abbiamo stabilito un modello ex vivo infezione dell'epidermide murine, che rappresenta il sito di infezione primaria e ricorrente in pelle. Il saggio comprende la preparazione della pelle murina. L'epidermide è separato dal derma mediante trattamento dispasi II. Dopo galleggiante i fogli epidermica su terreno contenente il virus, il tessuto è fisso e l'infezione può essere visualizzato in diversi momenti postinfection bycolorazione delle cellule infettate con un anticorpo contro la HSV-1 immediato proteina ICP0 presto. ICP0-esprimenti cellule può essere osservato nello strato basale cheratinociti già a 1,5 ore postinfection. Con tempi più lunghi di infezione, le cellule infettate vengono rilevati in strati soprabasali, indicando che l'infezione non si limita ai cheratinociti basali, ma il virus si diffonde ad altri livelli nel tessuto. Utilizzando fogli epidermico di vari modelli di mouse, il protocollo di infezione consente di determinare il coinvolgimento delle componenti cellulari che contribuiscono alla HSV-1 invasione nei tessuti. Inoltre, il saggio è adatto a testare inibitori nel tessuto che interferiscono con le fasi iniziali di entrata, diffusione cellula-cellula e la produzione di virus. Qui, descriviamo il protocollo ex vivo infezione in dettaglio e presentiamo i nostri risultati con i topi Nectin-1 o HVEM-carenti.

Introduzione

Herpes simplex virus (HSV) può causare una serie di malattie negli esseri umani da lievi lesioni mucocutanee semplici alle infezioni pericolose per la vita. HSV di tipo 1 (HSV-1) è prevalentemente associata a infezioni orofacciale e l'encefalite, mentre HSV di tipo 2 (HSV-2) più probabile causa di infezioni genitali ^1. Mentre non vi è un progresso significativo nella comprensione di come HSV entra nelle cellule in coltura, avvia l'infezione e produce progenie virale, sappiamo poco del percorso virale invasione (s) nel tessuto a livello cellulare ^2. Per gli studi di HSV infezioni della pelle o della mucosa, topi, conigli e cavie sono stati utilizzati come modelli animali. Infezione della pelle è stato istituito con iniezione intradermica o graffiare la pelle in presenza del virus, e lo sviluppo della malattia è stata correlata con la produzione di virus. Questi metodi hanno aiutato a comprendere vari aspetti della patogenesi della malattia, e sono utilizzate per valutare farmaci antivirali. Per studiare infezione da HSV al tissue livello, sono stati applicati modelli organotipica di pelle umana. Poiché il tasso di infezione è limitato in queste culture zattera, solo un numero limitato di studi che hanno valutato l'infezione, diffusione virale e gli effetti dei componenti antivirali sono stati pubblicati ^3-6.

Al fine di caratterizzare i determinanti cellulari che svolgono un ruolo durante HSV-1 nell'epitelio intatto, abbiamo stabilito un protocollo per la ex vivo studi infezioni dell'epidermide murini ^7. Pelle è stato preparato da neonati o dalle code di topi adulti. Dal momento che HSV-1 non è riuscito a infettare campioni di pelle completi, che sono stati immersi in mezzo contenente il virus, abbiamo separato l'epidermide dal derma da dispasi trattamento II. Dopo variabile dei fogli epidermica su terreno contenente il virus, cellule infettate possono essere visualizzati nello strato epidermico basale in vari momenti postinfection (pi) ^7. Per visualizzare l'inizio di infezione in cellule singole prima replica virale unnd produzione di virus, abbiamo macchiato con un anticorpo contro la proteina delle cellule infettate 0 (ICP0), che è una delle prime proteine ​​espresse durante HSV-1. La localizzazione cellulare di ICP0 passa attraverso fasi distinte durante l'infezione precoce. Mentre ICP0 è presente in foci nucleari in una fase precoce di espressione genica virale, rilocalizzazione di ICP0 al citoplasma indica una successiva fase di infezione ^8.

Abbiamo usato la ex vivo di infezione test di fogli epidermica da diversi modelli murini per testare il potenziale ruolo di diversi fattori cellulari durante l'infezione. Per affrontare l'impatto di Rac1 come un regolatore chiave delle dinamiche di actina, abbiamo infettati l'epidermide di topi con delezione specifica per cheratinociti del gene Rac1 ^9. Questo modello ha permesso di studiare le conseguenze delle carenti Rac1 sull'efficienza di HSV-1 negli strati epidermici cheratinociti. Il confronto di epidermide infette del controllo littermates ririvelò alcuna differenza significativa, indicando che l'assenza di Rac1 non ha avuto effetto sulla apertura di infezione nello strato basale dell'epidermide ^7. L'utilizzo di ulteriori modelli murini ci ha permesso di affrontare le quali recettori cellulari mediano ingresso nell'epidermide. Infettare fogli epidermica sia da nectin-1 o topi HVEM-deficienti con HSV-1 ha rivelato che l'ingresso del virus iniziale in tessuto dipende fortemente dalla presenza di nectin-1 ^10. Inoltre, i nostri risultati dimostrano che HVEM può anche servire come recettore nell'epidermide murini, anche se meno efficiente rispetto nectin-1 ^10.

Per affrontare la distribuzione spaziale delle cellule infettate negli strati epidermici, visualizziamo espressione ICP0 in sezioni di tessuto e epidermiche monti interi (Figura 1). In criosezioni di pelle completa, nessuna cellula-ICP0 esprimono vengono rilevati (Figura 1). Al contrario, criosezioni di fogli epidermiche dimostrano citoplasmaticaEspressione ICP0 nello strato basale a 3 ore già pi (Figura 1). In tempi più recenti, la diffusione virale di soprabasali strati può essere visualizzato. La distribuzione spaziale delle cellule infette nello strato basale può essere facilmente seguita in epidermiche supporti interi (Figura 1). Al momento l'infezione da HSV-1 a 100 PFU / cellula, circa il 50% dei cheratinociti basali dell'epidermide interfollicolari mostrano espressione ICP0 a 1,5 ore pi A questo punto momento cellule più infettate esprimono ICP0 nucleare. La rilocalizzazione della ICP0 nel citoplasma che indica una fase successiva dell'espressione genica precoce è presente in quasi tutte le cellule a 3 ore pi (Figura 1). Queste modalità di visualizzazione cellule infette su ex vivo HSV-1 forniscono un potente test per studiare l'effetto degli inibitori o di componenti cellulari mutate cancellati / su ingresso del virus e la diffusione nel tessuto.

Protocollo

Dichiarazione Etica.

La preparazione di fogli epidermici di animali sacrificati viene effettuata in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida di Landesamt für Natur, Umwelt e Verbraucherschutz, Nord Reno-Westfalia (Germania). Lo studio è stato approvato dal LANUV NRW (Numero 8.84-02.05.20.13.018).

1. Preparazione degli strumenti e cultura dei media

1. Coltivare fogli epidermica in mezzo modificato Eagle Dulbecco (DMEM) / alto glucosio contenente glutamina dipeptide, il 10% FCS, 100 UI / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina (di seguito denominato "DMEM").
2. Per la preparazione di fogli epidermiche, sciogliere accuratamente dispasi II polvere (5 mg / ml) in PBS riscaldata (fino a 37 ° C). Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e utilizzarlo direttamente per il trattamento.
3. Per la preparazione di epidermica intero monta ^13, preparare il blocco appassionatoer con 0,5% di latte in polvere, 0,25% di gelatina dall'acqua fredda pelle di pesce e 0,5% Triton X-100 in TBS. Consentire sostanze per sciogliere incubando la miscela per almeno 2 ore a RT su un agitatore rotante. Anche preparare 0,2% Tween 20 in PBS come tampone di lavaggio. Per la fissazione, preparare 3,4% e 4% formaldeide in PBS.
4. Per la immunocolorazione di criosezioni, preparare un tampone bloccante con 5% di siero di capra normale e 0,2% Tween 20 in PBS. Per la fissazione, preparare 0,5% di formaldeide in PBS.

2. Preparazione di fogli epidermico da pelle murino

1. Preparazione di epidermide da pelle posteriore neonato per gli studi di infezione
   1. Collocare un mouse decapitati (da 1 a 3 giorni dopo la nascita) in un piatto dissezione e tagliare le estremità e la coda vicino al torso per consentire la rimozione efficiente della pelle dal torso completa. Durante la rimozione delle estremità, cercare di mantenere i tagli più piccolo possibile di diametro.
   2. Fissare il torso curvo con una pinza sottilend spostare delicatamente le forbici punta smussa sotto la pelle dal cranio caudale a lungo la parte posteriore per separare la pelle dal busto. Incidete la pelle lungo la parte posteriore.
   3. Per l'analisi FACS, isolamento di cheratinociti o la preparazione di RNA, staccare la pelle completo dal tronco con pinze per fissare il tessuto e le forbici punta smussata per spingere fuori il busto. Per la preparazione di criosezioni o supporti interi prendere solo pezzi di pelle indietro.
   4. Tritate la pelle torna con un bisturi in 1-2 pezzi di circa 10 x 10 mm. Mettete i pezzi in un pozzetto di un 6-pozzetti con ~ 1 ml di PBS sterile. Assicurarsi che il lato dermico affaccia sul fondo.
   5. Sostituire PBS da 1,5 ml dispasi II (5 mg / ml PBS) e incubare per entrambi 30 minuti a 37 ° C (per i supporti interi) o O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS. Rimuovere delicatamente l'epidermide come un foglio intatto utilizzando una pinza per riparare il derma sottostante e le altre pinze per sollevare l'epidermide. Utilizzare un binocolo a fare questo passo easa. Trasferire il foglio epidermica in DMEM con il lato basale verso il fondo. Utilizzare immediatamente le lenzuola per gli esperimenti di infezione.
      NOTA: Utilizzare la preparazione di epidermide dalla pelle appena nato principalmente per l'analisi FACS, isolamento di cheratinociti o la preparazione di RNA. A causa della sua fragilità, la preparazione di fogli infettati per criosezioni o supporti interi è meno adatto.
2. Preparazione di epidermide da pelle coda adulto per gli studi di infezione
   1. Euthanize i topi all'età di 1 a 3 mesi per dislocazione cervicale. Prendere coda invece di pelle indietro da allora i follicoli dei capelli lunghi integrati sul retro ostacolano separazione dei fogli epidermico intatte. Tagliare la coda di topi sacrificati e fessura nel senso della lunghezza con un bisturi.
   2. Staccare la pelle dalle ossa e tritarlo con un bisturi in pezzi di circa 5 x 5 mm. Mettere fino a 4 pezzi in un unico bene e procedere con l'incubazione in dispasi II come descritto nella sezione 2.1.5
      NOTA: Utilizzare tai adultil pelle per preparare criosezioni o supporti interi. In alternativa l'uso immediato, code possono essere immagazzinati o trasportati per circa 24 ore a 4 ° C senza perdere significativo l'efficienza dell'infezione. Se esce croce sono mantenuti fino a 48 ore, lenzuola epidermici potrebbero essere difficilmente infettati con HSV-1.
3. Dissociazione dell'epidermide per analisi FACS
   NOTA: Il rilevamento di superficie espressione della proteina mediante analisi FACS richiede adeguate tecniche di dissociazione cellulare che non danneggiano la superficie della cellula e la proteina di interesse.
   1. Incubare fogli epidermica appena nati in un 6-pozzetti con la parte basale a 1,5 ml / soluzione dissociazione cella ben ricombinante basato tripsina-per 15 minuti a RT e per 15 minuti a 37 ° C.
   2. Fermare l'incubazione con l'aggiunta di 3 ml di DMEM. Dissociarsi cheratinociti utilizzando un curva pinza sottile per muovere delicatamente l'epidermide in 6 pozzetti in modo che i cheratinociti si dissolvono. Raccogliere la sospensione cellulare e ripetere l'operazione 3 voltesempre utilizzando DMEM fresco.
      NOTA: Questa procedura di dissociazione è opportuno rilevare nectin-1 sulla superficie dei cheratinociti.
   3. In alternativa, incubare le lenzuola epidermiche di soluzione dissociazione cella priva di enzima (CDS) per 15 minuti a temperatura ambiente e 15 minuti a 37 ° C. Incubare altri 15 minuti a temperatura ambiente per irrigare delicatamente i cheratinociti pipettando CDS su e giù.
   4. Raccogliere la sospensione cellulare e ripetere il passaggio di risciacquo 3 volte utilizzando DMEM fresco.
      NOTA: Questa dissociazione è atto a rilevare l'espressione superficie HVEM. Lo svantaggio della soluzione CDS è che meno cellule sono dissociate che con soluzione ricombinante dissociazione cellulare basato tripsina. Oltre alla superficie espressione, espressione nucleare o citoplasmatica come espressione ICP0 può essere analizzato mediante FACS dopo dissociazione dei fogli epidermica infetti con soluzione ricombinante dissociazione cellulare basato tripsina.
4. La dissociazione di epidermide per isolare cheratinociti o extratto RNA
   1. Mettere fogli epidermiche neonato in una piastra da 6 pozzetti con il lato basale verso il fondo del piatto che contiene 1,5 ml / soluzione ben ricombinante dissociazione cellulare basato tripsina. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 3 ml di DMEM e dissociare cheratinociti utilizzando un curva pinza sottile per spostare delicatamente l'epidermide nel piatto.
   2. Raccogliere la sospensione cellulare e ripetere l'operazione 3 volte utilizzando DMEM fresco. Utilizzare questa sospensione cellulare per estrarre l'RNA o alla cultura primari cheratinociti murini.

3. L'infezione di fogli epidermico con HSV-1

1. Preparare una soluzione di HSV-1 wt ceppo 17 ¹¹ in non meno di 500 microlitri DMEM e sostituire il mezzo dalla soluzione virus cui i fogli epidermici sono flottanti. Questo punto di tempo viene definito come tempo 0 ^12. Eseguire infezione di un foglio epidermica in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti a 37 ° C. Il calcolo del titolo virale è basato sul numero stimatodelle cellule nello strato basale per foglio epidermica (circa 2 x 10 ⁵ cellule per foglio 5 x 5 mm).
2. Infettare con HSV-1 a circa 100 unità formanti placca (PFU) / cellulare e sostituire il medio virus contenente in DMEM a 1 ora pi
   NOTA: Nel caso di fogli epidermica dalla pelle neonato, tenere a mente che i fogli cominciano a dissociarsi durante l'incubazione.

4. Visualizzazione delle cellule infettate

1. Epidermal intero Monti ¹³
   1. Fissare fogli epidermico con il 3,4% di formaldeide o per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Lavare due volte con PBS e bloccare con 0,5% di latte in polvere, 0,25% di gelatina dall'acqua fredda pelle di pesce e 0,5% Triton X-100 in TBS per 1 ora a RT ^14.
   2. Incubare le lenzuola O / N con topo anti-ICP0 (anticorpo monoclonale 11060) ¹⁵ diluito 1:60 in tampone di bloccaggio a temperatura ambiente. Per visualizzare la rete di filamenti intermedi incubare contemporaneamente policlonale di coniglio anti-Mouse cheratina 14 (100 ng / ml).
   3. Lavare 4 a 5 volte con PBS-Tween 20 0,2% durante 4 ore a temperatura ambiente. Incubare O / N con AF488-coniugato anti-IgG di topo (1 mg / ml), IgG anti-coniglio AF555-coniugato (1 mg / ml), e DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) (100 ng / ml) in tampone di bloccaggio a RT.
   4. Lavare con PBS-Tween 20 0,2% per 4 ore a temperatura ambiente. Fogli epidermico Mount con la loro parte basale sulla cima di un vetrino, incorporare nel mezzo di montaggio fluorescente e coprire con coprioggetto.
2. Epidermal criosezioni
   1. Fogli epidermiche di età sono stati fissati in formaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a RT e lavate 2 volte con PBS. Fogli fissi Incorpora in tessuto di congelamento medio e congelare in azoto liquido. Tagliare 8-10 sezioni micron con un criomicrotomo.
   2. Fissare nuovamente le sezioni con 0,5% di formaldeide in PBS per 10 minuti a RT, lavare 2 volte con PBS, blocco con 5% di siero di capra normale e 0,2% Tween 20 in PBS per 30 minuti a RT, e quindi macchiare per 60 min con mOuse anti-ICP0 (anticorpo monoclonale 11060) ¹⁵ diluito 1:60 in tampone bloccante, seguito da 3 tempi di lavaggio con il tampone di bloccaggio.
   3. Poi incubare con AF488-coniugato anti-IgG di topo (1 mg / ml) e DAPI (100 ng / ml) in tampone bloccante per 45 minuti a RT e lavare 3 volte. Sezioni incorporare nel mezzo di montaggio fluorescente e coprire con coprioggetto.

Risultati

La sfida del metodo è quello di preparare fogli epidermici in cui HSV-1 possono penetrare dallo strato basale. La fase critica è la separazione dell'epidermide dal derma mediante trattamento dispasi II, che, a seconda del ceppo di topo, deve essere adattato. La concentrazione di dispasi II può variare da 2.5 a 5 mg / ml, e il tempo di incubazione da 20 a 45 min. La colorazione del filamento intermedio proteina cheratina 14 permette facilmente predire se lo strato epidermico basale può essere infettati o se mostr...

Discussione

Quando i fogli epidermica di pelle adulta da C57BL / 6 sono infettati con HSV-1 a circa 100 PFU / cellula, osserviamo l'infezione in quasi tutte le cellule dello strato basale dell'epidermide interfollicolari mentre dosi virali inferiori correlano con le cellule meno infette e una più lenta progresso dell'infezione. In generale, i follicoli piliferi mostrano un numero variabile di cellule infettate; mentre la maggior parte dei piccoli piuttosto cheratinociti che rivestono i follicoli dei capelli in via di s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus