Экс Vivo Заражение мышиных эпидермиса с вирусом простого герпеса типа 1

Резюме

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Аннотация

Чтобы ввести свой человеческий хозяина, вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1), должны преодолеть барьер слизистой оболочки поверхностей, кожи, или роговицы. ВПГ-1 кератиноцитов цели во время начальной записи и устанавливает первичной инфекции в эпителии, за которым следует латентной инфекции нейронов. После реактивации, вирусы могут стать очевидным при кожно-сайтов, которые появляются, как пузырьки кожи и слизистых язв. Как ВПГ-1 поражает кожу или слизистую оболочку и достигает его рецепторы плохо понял. Для исследования вторжения маршрут ВПГ-1 в эпидермальной ткани на клеточном уровне, мы установили экс естественных условиях инфекция модель мышиных эпидермиса, который представляет сайт первичной и рецидивирующей инфекции в коже. Анализ включает в себя подготовку мышиной кожи. Эпидермис отделен от дермы путем обработки диспаза II. После плавающей эпидермиса листа на вирус среде, содержащей, ткань является фиксированной и инфекция может быть визуализированы в разное время по постинфекционныеокрашивания инфицированных клеток с антителами против ВПГ-1 немедленного раннего ICP0 белка. ICP0-экспрессирующих клеток может наблюдаться в базальном слое кератиноцитов уже на 1,5 ч постинфекционные. С более длительным временем инфекции, инфицированные клетки обнаружены в супрабазальных слоев, указывая, что инфекция не ограничивается базальных кератиноцитов, но вирус распространяется на другие слои в ткани. Использование эпидермиса листы различных мышиных моделях, протокол инфекции позволяет определить участие клеточных компонентов, которые способствуют ВПГ-1 в ткани вторжения. Кроме того, анализ подходит для тестирования ингибиторов в тканях, которые мешают начальных шагов входа, распространение клетки к клетке и производство вирусов. Здесь мы опишем экс естественных условиях протокол инфекции в деталях и представить наши результаты, используя nectin-1- или Hvem-дефицитных мышей.

Введение

Вирус простого герпеса (ВПГ) может вызвать целый ряд заболеваний у людей с умеренными неосложненных поражений слизистых до угрожающих жизни инфекций. ВПГ 1 (HSV-1) преимущественно связана с орофациальных инфекций и энцефалита, тогда как ВПГ 2 (HSV-2), более вероятно вызывает генитальные инфекции ^1. В то время как существует значительный прогресс в понимании того, как ВПГ входит в культуре клеток, инициирует инфекции и производит потомство вирусной, мы мало знаем о вирусной инвазии пути (ов) в ткани на клеточном уровне ^2. Для изучения HSV кожи или слизистой оболочки, инфекции мышей, кроликов и морских свинок были использованы в качестве модельных животных. Инфекции кожи был создан внутрикожной инъекцией или царапин кожи в присутствии вируса, и развитие болезни коррелирует с продукции вируса. Эти методы помогли понять различные аспекты патогенеза заболевания, и используются для оценки противовирусные препараты. Для изучения HSV-инфекции в Tissuе уровня, органотипической модели кожи человека были применены. Как скорость распространения инфекции ограничен в этих плот культур, лишь ограниченное число исследований следственных инфекции, распространение вируса и последствий антивирусных компонентов были опубликованы ^3-6.

Для того чтобы охарактеризовать клеточные детерминанты, которые играют роль в HSV-1 инфекции в неповрежденной эпителия, мы создали протокол для бывших естественных инфекции исследований мышиных эпидермиса ^7. Кожа получали из новорожденных или из хвостов взрослых мышей. Так ВПГ-1 не может инфицировать полные образцы кожи, которые были погружены в вирус-содержащей среде, мы разделены эпидермис от дермы путем обработки диспаза II. После плавающей эпидермиса листов на вирус среде, содержащей, инфицированные клетки могут быть визуализированы в эпидермального базального слоя в разное время постинфекционные (PI) ^7. Для визуализации инициации инфекции в отдельных клетках до вирусной репликации аго производство вируса, мы окрашивали антителами против зараженной клетки-белка 0 (ICP0), который является одним из первых белков, выраженных в ходе HSV-1 инфекции. Клеточная локализация ICP0 проходит через различные фазы в начале инфекции. В то время как ICP0 присутствует в ядерной очагов на ранней стадии экспрессии вирусных генов, релокализации ICP0 в цитоплазму указывает более позднюю фазу инфекции ^8.

Мы использовали экс естественных условиях инфекция анализа эпидермиса листов из разных мышиных моделях, чтобы проверить потенциальную роль различных клеточных факторов во время инфекции. Для устранения последствий Rac1 в качестве ключевого регулятора динамики актина, мы заражены эпидермис мышей с кератиноцитов конкретных удаление гена Rac1 ^9. Эта модель позволила нам изучить последствия недостаточного Rac1 на эффективность ВПГ-1 инфекции в эпидермального кератиноцитов слоев. Сравнение с зараженных эпидермиса управления помета повторноне ружены никакого существенного различия, указывая, что отсутствие Rac1 не имели никакого эффекта на инициации инфекции в базального слоя эпидермиса ^7. Использование дополнительных мышиных моделях позволили нам обратиться, какие клеточные рецепторы опосредуют вступления в эпидермисе. Заражение эпидермальные листов или из nectin-1- или HVEM-дефицитных мышей с ВПГ-1 показали, что начальная проникновение вируса в ткани сильно зависит от наличия nectin-1 ^10. Кроме того, наши результаты показывают, что HVEM может также служить в качестве рецептора в мышиных эпидермиса, хотя менее эффективно, чем nectin-1 ^10.

Для решения пространственное распределение инфицированных клеток в эпидермального слоев, мы представляем себе ICP0 выражение в срезах тканей и эпидермиса тотальных (рисунок 1). В криосрезов полной кожи, не ICP0-экспрессирующие клетки не обнаружены (рисунок 1). В противоположность этому, криосрезы эпидермальных листов демонстрируют цитоплазматическиеICP0 выражение в базального слоя уже в 3 часа пи (рисунок 1). В более поздние времена, вирусная распространяется на супрабазальных слои могут быть визуализированы. Пространственное распределение зараженных клеток базального слоя могут быть легко проследить в эпидермальных тотальных (рисунок 1). После инфицирования ВПГ-1 при 100 КОЕ / клетку, примерно 50% из базальных кератиноцитов в эпидермисе межфолликулярного показать ICP0 выражение в 1,5 ч пи В этот момент времени большинство инфицированных клетки экспрессируют ядерный ICP0. Релокализации ICP0 в цитоплазму с указанием более поздней стадии выражения начале гена присутствует почти во всех клетках в 3 ч пи (рисунок 1). Эти режимы визуализации инфицированные клетки при экс естественных условиях ВПГ-1 инфекции дают мощный анализ для изучения влияния ингибиторов или удаленных / мутантных клеточных компонентов на проникновения вируса и распространения в тканях.

протокол

Заявление по этике.

Подготовка эпидермиса листов из жертвенных животных осуществляется в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по Landesamt für Umwelt, Natur и Verbraucherschutz, Северный Рейн-Вестфалия (Германия). Исследование было одобрено LANUV NRW (номер 8.84-02.05.20.13.018).

1. Подготовка инструментов и культуры Медиа

1. Выращивают эпидермальные листов в среде Игла в модификации Игла (DMEM) / высокий уровень глюкозы, содержащий глутамин дипептид, 10% FCS, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (именуемое в дальнейшем "DMEM").
2. Для приготовления эпидермальных листов, тщательно растворить диспаза II порошок (5 мг / мл) в PBS с подогревом (до 37 ° C). Фильтр решение через 0,22 мкм фильтр и использовать его непосредственно на лечение.
3. Для получения эпидермиса целом монтирует ^13, подготовить блокирования баффэр 0,5% сухого молока, 0,25% желатина от холодной воды рыбьей кожи и 0,5% Triton X-100 в TBS. Разрешить растворение веществ путем инкубации смеси в течение по крайней мере 2 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. Также приготовьте 0,2% Твин-20 в PBS, как промывочного буфера. Для фиксации, подготовить 3,4% и 4% формальдегида в PBS.
4. Для иммунным криосрезах, подготовить блокирующий буфер с 5% нормальной козьей сыворотки и 0,2% Tween 20 в PBS. Для фиксации, подготовить 0,5% формальдегида в PBS.

2. Подготовка эпидермиса листа из мышиной кожи

1. Подготовка эпидермиса от новорожденного кожу спины для инфекции исследований
   1. Поставьте обезглавленное мышь (от 1 до 3 дней после рождения) в рассечение блюдо и отрезать конечности и хвост близко к туловищу, чтобы эффективное удаление кожи из полного туловища. Во время удаления конечностей, старайтесь держать сокращения как можно в диаметре.
   2. Закрепите торс с изогнутой тонкой щипцов аND осторожно двигаться тупые ножницы наконечник под кожей от головы к хвосту вдоль спины, чтобы отделить кожу от туловища. Разрежьте кожу вдоль спины.
   3. Для FACS анализа, выделения кератиноцитов или подготовки РНК, снимите кожу полную от туловища с помощью щипцов для фиксации ткани и тупые ножницы наконечника оттолкнуться туловище. Для приготовления криосрезах или тотальных принимать только куски кожу спины.
   4. Чоп заднюю кожу скальпелем в 1-2 кусков приблизительно 10 х 10 мм. Поместите части в одну лунку 6-луночного планшета с ~ 1 мл стерильной PBS. Убедитесь, что кожный сторона сталкивается дно.
   5. Заменить PBS с 1,5 мл диспаза II (5 мг / мл PBS) и инкубируют в течение либо 30 мин при 37 ° С (для крепления) целых или O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза ЗФР. Аккуратно снимите эпидермис как нетронутыми листа с использованием одного щипцы, чтобы исправить основные дермы и другие щипцы, чтобы поднять эпидермиса. Используйте бинокль, чтобы этот шаг EASу. Передача эпидермальный лист в DMEM с базальной стороне в направлении нижней части. Сразу Используйте листы для инфекции экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте подготовку эпидермиса от новорожденного кожи, главным образом, для FACS анализа, выделения кератиноцитов или подготовки РНК. Из-за его хрупкости, подготовка инфицированных листов для криосрезах или тотальных менее пригоден.
2. Подготовка эпидермиса от взрослой кожи хвоста для инфекции исследований
   1. Усыпить мышей в возрасте от 1 до 3 месяцев по цервикальной дислокации. Возьмите хвост вместо кожу спины, так как давно встроенные волосяные фолликулы на задней затруднить разделение нетронутыми эпидермиса листов. Отрежьте хвост из жертвенных мышей и перерезал ее вдоль скальпелем.
   2. Слезьте кожу от костей и нарезать его скальпелем на кусочки примерно 5 х 5 мм. Положите до 4 штук в одной скважине и приступить к инкубации в диспазу II, как описано в 2.1.5
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте взрослых тайл кожа подготовить криосрезы или тотальных. В качестве альтернативы к немедленному использованию, хвосты можно хранить или транспортировать в течение примерно 24 ч при температуре 4 ° С без потери значительного эффективность инфекции. Если хвосты хранятся до 48 часов, эпидермальные листы могут быть едва инфицированных ВПГ-1.
3. Диссоциация эпидермиса для анализа FACS
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение поверхностного экспрессии белка путем анализа FACS требует соответствующих методов клеточной диссоциации, что не вредят поверхности клеток и белка.
   1. Инкубируйте новорожденных эпидермальные листов в 6-луночный планшет с базальной стороне от 1,5 мл / лунку рекомбинантного трипсина на основе диссоциации клеток раствор в течение 15 мин при комнатной температуре и в течение 15 мин при 37 ° С.
   2. Остановка инкубации добавлением 3 мл DMEM. Разбить кератиноцитов с помощью изогнутой тонких щипцов, чтобы аккуратно двигаться эпидермис в пластине 6-а, так что кератиноциты раствориться. Сбор суспензии клеток и повторите этот шаг 3 разавсегда свежих DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура диссоциации уместно определить nectin-1 на поверхности кератиноцитов.
   3. В качестве альтернативы, инкубировать эпидермальные листов на фермента раствора без диссоциации клеток (CDS) в течение 15 мин при комнатной температуре и 15 мин при 37 ° С. Выдержите еще 15 мин при комнатной температуре, чтобы мягко избавиться кератиноцитов с помощью пипетки CDS вверх и вниз.
   4. Сбор суспензии клеток и повторите шаг Промывка 3 раза с использованием свежей DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот диссоциации подходит для обнаружения поверхностную экспрессию HVEM. Недостатком раствора CDS, что меньше клетки диссоциируют, чем рекомбинантным трипсина на основе раствора для диссоциации клеток. В дополнение к поверхностной экспрессии, ядерная или цитоплазматической экспрессии, такие как выражение ICP0 могут быть проанализированы FACS после диссоциации инфицированных эпидермиса листов с рекомбинантным трипсина на основе раствора для диссоциации клеток.
4. Диссоциация эпидермиса, чтобы изолировать кератиноциты или эксРНК-кишечного тракта
   1. Поместите новорожденных эпидермальные листов в 6-луночный планшет с базальной стороне в направлении нижней части блюда, содержащего 1,5 мл / лунку рекомбинантного трипсина на основе решения для диссоциации клеток. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавить 3 мл DMEM и отделить кератиноцитов с помощью изогнутой тонких щипцов, чтобы аккуратно двигаться эпидермис в блюдо.
   2. Сбор суспензии клеток и повторите этот шаг 3 раза с использованием свежей DMEM. Используйте этот суспензии клеток, чтобы извлечь РНК или первичной культуры мышиных кератиноцитов.

3. Заражение Эпидермальные листов с ВПГ-1

1. Приготовьте раствор ВПГ-1 мас штамма 17 ¹¹ в не менее 500 мкл DMEM и заменить среду вирусом решения, на которых эпидермиса листы с плавающей запятой. Этот момент времени определяется как момент времени 0 ^12. Выполнение инфекции эпидермального листа в одну лунку 24-луночного планшета при 37 ° С. Расчет титра вируса на основе расчетного числаклеток в базальный слой эпидермиса листа на (примерно 2 ^× 10 5 клеток на 5 х 5 мм листа).
2. Инфекция ВПГ-1 приблизительно в 100 бляшкообразующих единиц (БОЕ) / клетки и замените вирусов, содержащих среду DMEM по состоянию на 1 ч пи
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае эпидермиса листа из новорожденного кожи, имейте в виду, что листы начинают диссоциировать во время инкубации.

4. Визуализация инфицированных клеток

1. Эпидермального тотальных ¹³
   1. Исправление эпидермальные листы с 3,4% формальдегида либо в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Промыть два раза с PBS и блокируют 0,5% -ным сухим молоком, 0,25% желатина от холодной воды рыбьей кожи и 0,5% Triton X-100 в TBS в течение 1 ч при комнатной температуре ^14.
   2. Выдержите листы О / N с мыши анти-ICP0 (моноклональное антитело 11060) ^15, разбавленного 1:60 в блокирующем буфере при комнатной температуре. Для визуализации промежуточную сеть, нити инкубировать одновременно с кроликом поликлональных антимыши кератина 14 (100 нг / мл).
   3. Промыть 4 до 5 раз с PBS-0,2% Твин 20 в течение 4 ч при комнатной температуре. Инкубируйте O / N с AF488-конъюгированного антитела против мышиного IgG (1 мкг / мл), AF555, конъюгированных анти-кроличий IgG (1 мкг / мл), и DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) (100 нг / мл) в блокирующем буфере при комнатной температуре.
   4. Промыть PBS-0,2% Tween 20 в течение 4 ч при комнатной температуре. Mount эпидермиса листа с их базальной стороне на вершине образца слайда, вставлять в люминесцентной монтажа среды и накрыть покровные.
2. Эпидермального криосрезы
   1. Взрослые эпидермальные листы фиксировали в 4% формальдегиде в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре и промывают 2 раза PBS. Код для вставки листов в фиксированных тканей замораживания среды и замораживание в жидком азоте. Вырезать 8-10 мкм разделы с cryomicrotome.
   2. Закрепить снова секции с 0,5% формальдегида в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре, мыть 2 раза PBS, блок с 5% нормальной козьей сывороткой и 0,2% Tween 20 в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем окрашивают в течение 60 минут с мУз анти-ICP0 (моноклональное антитело 11060) ¹⁵ разбавляют 1:60 в блокирующем буфере, а затем 3 раза, омывающих с блокирующим буфером.
   3. Затем инкубируют с конъюгированным AF488 против мышиного IgG (1 мкг / мл) и DAPI (100 нг / мл) в блокирующем буфере в течение 45 мин при комнатной температуре и промыть 3 раза. Вставить разделы в люминесцентной монтажа среды и накрыть покровные.

Результаты

Задача метода состоит в подготовке эпидермиса листа, в который ВПГ-1 может проникать из базального слоя. Критической стадией является отделение эпидермиса от дермы путем диспаза II лечения, который, в зависимости от штамма мыши, должна быть адаптирована. Концентрация диспаза II может быт...

Обсуждение

При эпидермальные листы взрослого кожи от мышей C57BL / 6, инфицированных ВПГ-1 при температуре приблизительно 100 КОЕ / клетку, мы наблюдаем инфекции почти во всех клеток базального слоя в межфолликулярного эпидермиса, а более низкие доз вируса коррелируют с менее инфицированных клеток и м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus