זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

Summary

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Abstract

כדי להיכנס למארח האנושי שלה, סוג נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) חייב להתגבר על המחסום של משטחים, עור, או קרנית רירית. HSV-1 מטרות קרטינוציטים בכניסה ראשונית וקובעות זיהום עיקרי באפיתל, שאחריו זיהום סמוי של תאי עצב. לאחר הפעלה מחדש, וירוסים יכולים להיות ברורים באתרי mucocutaneous המופיעים כשלפוחית ​​עור או כיבים ברירית. איך HSV-1 פולש עור או רירי ומגיע הקולטנים שלו הוא הבין היטב. כדי לחקור את מסלול הפלישה של HSV-1 לרקמת אפידרמיס ברמה התאית, הקמנו מודל vivo לשעבר זיהום של עור בעכברים, המייצג את האתר של זיהום ראשוני וחוזר בעור. Assay כולל הכנת העור בעכברים. האפידרמיס מופרד מהעור על ידי טיפול dispase השני. לאחר צף גיליונות אפידרמיס על מדיום המכיל וירוס, הרקמה היא קבועה וזיהום יכול להיות דמיין בpostinfection זמנים שונים על ידימכתים תאים נגועים בנוגדן נגד חלבון ICP0 HSV-1 מוקדם המיידי. להביע ICP0 תאים ניתן להבחין בשכבת keratinocyte הבסיסית כבר ב1.5 postinfection שעות. עם זמני זיהום יותר, תאים נגועים מתגלים בשכבות suprabasal, מצביעים על כך שהזיהום אינו מוגבל לקרטינוציטים הבסיסיים, אבל הווירוס מתפשט לשכבות אחרות ברקמות. שימוש בגיליונות אפידרמיס של מודלים עכבר שונים, פרוטוקול הזיהום מאפשר קביעת המעורבות של מרכיבים תאיים שתורמים לפלישת HSV-1 לרקמות. בנוסף, assay מתאים לבחון מעכבים ברקמה שמפריעים לצעדי כניסה הראשוניים, התפשטות תא אל התא וייצור וירוס. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול זיהום vivo לשעבר בפירוט ולהציג את התוצאות שלנו באמצעות עכברי nectin-1- או HVEM הלקוי.

Introduction

וירוס הרפס סימפלקס (HSV) עלול לגרום למגוון של מחלות בבני אדם מנגעי mucocutaneous מסובכים קלים לזיהומים מסכני חיים. סוג HSV 1 (HSV-1) קשור דומיננטי עם זיהומים ודלקת המוח orofacial, ואילו HSV מסוג 2 (HSV-2) סביר יותר גורם לזיהומים באברי המין ^1. אמנם יש התקדמות משמעותית בהבנה כיצד HSV נכנס תאים בתרבית, יוזם זיהום ומייצר צאצאים נגיפיים, אנחנו יודעים מעט מאוד על מסלול ויראלי הפלישה (ים) לתוך רקמה ברמה התאית ^2. ללימודים של עור HSV או זיהומים ברירית, עכברים, ארנבות ושרקנים שימשו כמודלים של בעלי חיים. דלקת עור הוקמה על ידי הזרקה תוך-או על ידי מגרד את העור בנוכחות של וירוס, והתפתחות מחלה הייתה מתואמת עם ייצור וירוס. שיטות אלה עזרו להבין היבטים שונים של היווצרות מחלה, והם משמשים להערכת תרופות אנטי. ללמוד זיהום HSV בtissuרמת ה, מודלים עור אנושיים organotypic יושמו. כשיעור הזיהום מוגבל בתרבויות רפסודה אלה, רק מספר מוגבל של מחקרים חוקרים זיהום, התפשטות נגיפית ואת ההשפעות של רכיבים אנטי פורסמו ^3-6.

כדי לאפיין גורמים סלולריים שמשחקים תפקיד בזיהום HSV-1 באפיתל שלם, הקמנו פרוטוקול ללימודי זיהום vivo לשעבר של האפידרמיס עכברי ^7. עור הוכן מתינוקות או מהזנבות של עכברים בוגרים. מאז HSV-1 לא יכל להדביק דגימות עור מלאים, שהיו שקועים במדיום המכיל וירוס, נפרדנו מהאפידרמיס הדרמיס על ידי הטיפול השני dispase. לאחר צף של גיליונות אפידרמיס על מדיום המכיל וירוס, ניתן דמיינו תאים נגועים בשכבת בסיס אפידרמיס בpostinfection השונים פעמים (PI) ^7. כדי להמחיש את החניכה של זיהום בתאים בודדים לפני שכפול נגיפיND ייצור וירוס, אנחנו מוכתמים עם נוגדן נגד החלבון נגוע תא 0 (ICP0), שהוא אחד מהחלבונים הראשונים הביעו במהלך זיהום HSV-1. הלוקליזציה הסלולרית של ICP0 עוברת דרך שלבים ברורים בזיהום מוקדם. בעוד ICP0 נמצא במוקדי גרעין בשלב מוקדם של ביטוי גנים נגיפי, relocalization של ICP0 לציטופלסמה מציין שלב הבא של זיהום ^8.

אנו משמשים assay זיהום vivo לשעבר של גיליונות אפידרמיס ממודלי עכבר שונים על מנת לבחון את התפקיד הפוטנציאלי של גורמים סלולריים שונים במהלך הדבקה. כדי לטפל בהשפעה של Rac1 כרגולטור מרכזי של דינמיקה אקטין, אנחנו נגועים האפידרמיס של עכברים עם מחיקת keratinocyte הספציפית של גן Rac1 ^9. מודל זה מאפשר לנו ללמוד את ההשלכות של Rac1 הלקוי על היעילות של זיהום HSV-1 בשכבות keratinocyte אפידרמיס. ההשוואה לעור נגוע של המלטת שליטה מחדשvealed אין הבדל משמעותי, מצביע על כך שהעדר Rac1 לא היה השפעה על תחילתו של זיהום בשכבת הבסיס של האפידרמיס ^7. השימוש במודלים של עכברים נוספים אפשרו לנו לטפל בי קולטנים סלולריים לתווך כניסה לאפידרמיס. הדבקת גיליונות אפידרמיס משני nectin-1- או עכברי HVEM לקויים עם HSV-1 עולה כי הכניסה הנגיפית הראשונית לרקמה מאוד תלויה בנוכחותו של nectin-1 ^10. יתר על כן, התוצאות שלנו מראות כי HVEM גם יכול לשמש כקולטן בעור בעכברים, אם כי בצורה פחות יעיל מאשר nectin-1 ^10.

כדי לטפל בפריסה המרחבית של תאים נגועים בשכבות אפידרמיס, אנחנו לדמיין ביטוי ICP0 בסעיפים רקמות וmounts אפידרמיס השלם (איור 1). בcryosections של עור מלא, לא להביע תאי ICP0 מזוהים (איור 1). לעומת זאת, cryosections של גיליונות אפידרמיס להפגין cytoplasmicביטוי ICP0 בשכבת הבסיס כבר בשעת 3 pi שעות (איור 1). בתקופות מאוחרות יותר, נגיפי מתפשט לsuprabasal שכבות ניתן דמיין. הפריסה המרחבית של תאים נגועים בשכבת הבסיס יכולה להיות בקלות מיושמת בmounts אפידרמיס השלם (איור 1). על זיהום HSV-1 ב 100 PFU / תא, כ -50% מקרטינוציטים הבסיס באפידרמיס interfollicular להראות ביטוי ICP0 1.5 pi משאבי אנוש בנקודה זו בזמן תאים הנגועים ביותר להביע ICP0 הגרעיני. Relocalization של ICP0 לציטופלסמה המציין שלב מאוחר יותר של ביטוי גנים המוקדם נמצא כמעט בכל התאים בשעה 3 pi (איור 1). מצבים אלה של הדמיה תאים נגועים על זיהום HSV-1 vivo לשעבר מספקים assay רב עוצמה כדי לחקור את ההשפעה של מעכבים או של רכיבים סלולריים מוטציה נמחקו / בכניסת ויראלי והתפשטות ברקמה.

Protocol

הצהרת אתיקה.

הכנת גיליונות אפידרמיס מחיות הקריבו מתבצעת בהתאם קפדן עם ההמלצות של המדריך של Landesamt für נאטור, Umwelt וVerbraucherschutz, Northrhine-וסטפליה (גרמניה). המחקר אושר על ידי LANUV NRW (מספר 8.84-02.05.20.13.018).

1. הכנה של מכשירים ותרבות מדיה

1. לטפח גיליונות אפידרמיס במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) / גלוקוז גבוהה המכיל Dipeptide גלוטמין, FCS 10%, 100 IU / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (להלן "DMEM").
2. להכנת גיליונות אפידרמיס, לפזר בזהירות dispase השנייה אבקה (5 מ"ג / מיליליטר) ב- PBS המחוממת (עד 37 מעלות צלזיוס). סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולהשתמש בו באופן ישיר לטיפול.
3. להכנת כל אפידרמיס mounts ^13, להכין חסימת חובבאה עם 0.5% אבקת חלב, ג'לטין 0.25% מעור דג מים קרים ו 0.5% Triton X-100 ב TBS. הרשה חומרים לפזר ידי דוגרים התערובת לפחות שעת 2 ​​ב RT על מיקסר מסתובב. כמו כן להכין 0.2% Tween 20 בPBS כחיץ כביסה. לקיבעון, להכין 3.4% ו -4% בפורמלדהיד PBS.
4. לimmunostaining של cryosections, להכין חיץ חסימה עם 5% בסרום נורמלי עז ושל 0.2% Tween 20 בPBS. לקיבעון, להכין פורמלדהיד 0.5% ב- PBS.

2. הכנת גיליונות עוריות מעור Murine

1. הכנת עור מעור חזרה זה עתה נולד ללימודי זיהום
   1. הנח עכבר ערוף (1 עד 3 ימים לאחר לידה) לתוך צלחת לנתיחה ומנותקת גפיים והזנב קרוב לגוף כדי לאפשר ההסרה יעילה של העור מהגוף השלם. במהלך ההסרה של הגפיים, מנסה לשמור על החתכים קטנים ככל האפשר בקוטר.
   2. תקן את פלג הגוף העליון עם מלקחיים בסדר מעוקליםnd בעדינות להזיז מספריים קצה קהים מתחת לעור מגולגולת לזנב לאורך הגב להפריד את העור מהגוף. שיסף את העור לאורך הגב.
   3. לניתוח FACS, הבידוד של קרטינוציטים או הכנה של RNA, לקלף את העור המלא מהגוף באמצעות מלקחיים כדי לתקן את הרקמות ומספרי קצה הקהים לדחוף את פלג הגוף העליון. להכנת cryosections או כל mounts לקחת חתיכות של עור הגב בלבד.
   4. קוצצים את עור הגב עם אזמל לתוך 1-2 חתיכות של כ 10 x 10 מ"מ. שים את חתיכות ובאחד 6-גם צלחת עם ~ 1 מיליליטר סטרילי PBS. ודא שצד העור פונה לתחתית.
   5. החלף PBS על ידי 1.5 מיליליטר dispase השני (5 מ"ג / מיליליטר PBS) ודגירה או 30 דקות ב 37 ° C (לכל mounts) או O / N ב 4 ° C. לשטוף 3 פעמים עם PBS. הוצא בעדינות את העור כגיליון שלם באמצעות אחד מלקחיים כדי לתקן את העור הבסיסי ומלקחיים האחרים כדי להרים את העור. השתמש במשקפת כדי להפוך EAS שלב זהy. העבר את גיליון לאפידרמיס DMEM עם הצד הבסיסי שלה לתחתית. השתמש בגיליונות מייד לניסויי זיהום.
      הערה: השתמש בהכנת עור מעור יילוד בעיקר לניתוח FACS, בידוד של קרטינוציטים או הכנה של RNA. בגלל השבריריות שלה, הכנת גיליונות נגועים לcryosections או כל mounts היא פחות מתאימה.
2. הכנת עור מעור זנב בוגר ללימודי זיהום
   1. להרדים את העכברים בגיל 1 עד 3 חודשים על ידי נקע בצוואר הרחם. קח זנב במקום עור גב מאז זקיקי שיער הארוך המוטבעים על הגב להפריע הפרדת גיליונות אפידרמיס בשלמותה. חותך את הזנב מעכברים הקריבו ושיסף אותו לאורכו עם אזמל.
   2. לקלף את העור מהעצם וקוצצים אותו עם אזמל לחתיכות של כ -5 X 5 מ"מ. לשים עד 4 חתיכות ובאחד ולהמשיך בדגירה בdispase השנייה כאמור ב2.1.5
      הערה: טאי המבוגר השתמשתי בעור l להכין cryosections או כל mounts. לחלופין לשימוש המיידי, ניתן לאחסן זנבות או מועברים לכ 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס מבלי לאבד יעילות זיהום משמעותית. אם זנבות נשמרים עד 48 שעות, גיליונות אפידרמיס יכולים להיות כמעט נגוע HSV-1.
3. ניתוק של האפידרמיס לניתוח FACS
   הערה: איתור של ביטוי חלבון פני השטח על ידי ניתוח FACS דורשת טכניקות ניתוק התא מתאימות שאינו פוגעות בתא השטח והחלבון של עניין.
   1. דגירה גיליונות אפידרמיס יילוד בצלחת 6 גם עם הצד הבסיסי על 1.5 מיליליטר פתרון / גם רקומביננטי מבוסס טריפסין תא דיסוציאציה במשך 15 דקות ב RT ובמשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
   2. לעצור את הדגירה על ידי הוספת 3 מיליליטר DMEM. לנתק קרטינוציטים באמצעות מלקחיים בסדר מעוקלים להעביר את האפידרמיס בעדינות בצלחת 6-כך טובה שקרטינוציטים לקבל מומסים. אסוף את ההשעיה התא ולחזור על פעולה זו 3 פעמיםתמיד באמצעות DMEM הטרי.
      הערה: הליך ניתוק זה הוא מתאים כדי לזהות nectin-1 על פני השטח של קרטינוציטים.
   3. לחלופין, דגירה גיליונות אפידרמיס על פתרון תא דיסוציאציה ללא אנזים (CDS) במשך 15 דקות ב RT ו- 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. דגירה 15 דקות נוספות ב RT כדי לשטוף את עדינות קרטינוציטים ידי pipetting CDS למעלה ולמטה.
   4. אסוף את ההשעיה התא ולחזור על שלב השטיפה 3 פעמים באמצעות DMEM הטרי.
      הערה: ניתוק זה מתאים כדי לזהות ביטוי פני השטח של HVEM. החסרון של פתרון ה- CDS הוא שפחות תאים הם ניתקו מאשר עם פתרון תא דיסוציאציה מבוסס טריפסין רקומביננטי. בנוסף למשטח ביטוי, ניתן לנתח ביטוי גרעיני או cytoplasmic כגון ביטוי ICP0 ידי FACS לאחר הניתוק של גיליונות אפידרמיס הנגועים עם פתרון תא דיסוציאציה מבוסס טריפסין רקומביננטי.
4. ניתוק של האפידרמיס כדי לבודד קרטינוציטים או לשעברRNA בדרכי
   1. שים גיליונות אפידרמיס יילוד בצלחת 6 גם עם צד הבסיס לכיוון החלק התחתון של המנה המכילה 1.5 מיליליטר / פתרון תא דיסוציאציה מבוסס טריפסין גם רקומביננטי. דגירה של 30 דקות ב RT. להוסיף 3 מיליליטר DMEM ולנתק קרטינוציטים באמצעות מלקחיים בסדר מעוקלים להזיז בעדינות את העור בצלחת.
   2. אסוף את ההשעיה התא ולחזור על פעולה זו 3 פעמים באמצעות DMEM הטרי. השתמש השעיה תא זה כדי לחלץ RNA או לקרטינוציטים עכברי עיקרי תרבות.

3. זיהום של גיליונות עוריות עם HSV-1

1. הכן פתרון של מתח WT HSV-1 17 ¹¹ בלא פחות מ -500 μl DMEM ולהחליף את המדיום על ידי פתרון הווירוס שבגיליונות אפידרמיס צפים. נקודת זמן זו מוגדרת כזמן 0 ^12. בצע זיהום של גיליון אפידרמיס ובאחד של צלחת 24 גם ב 37 מעלות צלזיוס. החישוב של כייל הנגיף מבוסס על המספר המשוערשל תאים בשכבת הבסיס לגיליון אפידרמיס (כ 2 x 10 ⁵ תאים בגיליון 5 X 5 מ"מ).
2. להדביק עם HSV-1 בכ -100 יחידות פלאק ויוצרים (PFU) / תא ולהחליף את המדיום המכיל וירוס על ידי DMEM בpi שעה 1
   הערה: במקרה של גיליונות אפידרמיס מעור תינוק, יש לזכור כי גיליונות להתחיל לנתק במהלך דגירה.

4. ויזואליזציה של תאים נגועים

1. אפידרמיס השלם ¹³ Mounts
   1. תקן גיליונות אפידרמיס עם פורמלדהיד 3.4% גם עבור שעה 2 ב RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף פעמיים עם PBS ולחסום עם 0.5% אבקת חלב, ג'לטין 0.25% מעור דג מים קרים ו 0.5% Triton X-100 בכפות עבור שעה 1 בגיל ¹⁴ RT.
   2. דגירה הגיליונות O / N עם אנטי-ICP0 עכבר (נוגדנים חד שבטיים 11060) ¹⁵ מדוללים 1:60 בחיץ חסימה ב RT. כדי להמחיש את רשת נימה ביניים דגירה בו זמנית עם הארנב polyclonal אנטיקרטין העכבר 14 (מיליליטר / 100 ng).
   3. לשטוף 4 עד 5 פעמים עם Tween%-0.2 PBS 20 במהלך 4 שעות ב RT. דגירה O / N עם IgG אנטי עכבר (1 מיקרוגרם / מיליליטר), IgG נגד הארנב AF555 מצומדות- (1 מיקרוגרם / מיליליטר), וDAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (100 ng AF488 מצומדות- / מיליליטר) בחסימת המאגר ב RT.
   4. לשטוף עם Tween%-0.2 PBS 20 במשך 4 שעות ב RT. גיליונות אפידרמיס הר עם הצד הבסיסי שלהם על גבי שקופית דגימה, להטביע במדיום הרכבה ניאון ולכסות עם coverslips.
2. אפידרמיס cryosections
   1. גיליונות אפידרמיס מבוגרים היו קבועים בפורמלין 4% ב- ​​PBS עבור 20 דקות ב RT ורחצו 2 פעמים עם PBS. להטביע גיליונות קבועים ברקמות הקפאה בינוניות והקפאה בחנקן נוזלי. חותך 8-10 מיקרומטר חלקים עם cryomicrotome.
   2. לתקן את הסעיפים שוב עם פורמלדהיד 0.5% ב PBS במשך 10 דקות ב RT, לשטוף 2 פעמים עם PBS, בלוק עם 5% בסרום נורמלי עז ושל 0.2% Tween 20 בPBS למשך 30 דקות ב RT, ולאחר מכן כתם דקות 60 מ 'עםהאוז אנטי-ICP0 (נוגדנים חד שבטיים 11060) ¹⁵ מדוללים 1:60 במאגר חסימה, ואחריו 3 פעמים כביסה עם חיץ החסימה.
   3. אז דגירה עם IgG AF488 מצומדות- אנטי עכבר (1 מיקרוגרם / מיליליטר) וDAPI (100 ng / ml) בחסימת חיץ במשך 45 דקות ב RT ולשטוף 3 פעמים. שבץ סעיפים בהרכבה בינונית ניאון ולכסות עם coverslips.

תוצאות

האתגר של השיטה הוא להכין גיליונות אפידרמיס שלתוכו HSV-1 יכול לחדור משיכבת הבסיס. השלב הקריטי הוא ההפרדה של האפידרמיס מהדרמיס על ידי טיפול dispase השני, אשר, בהתאם לזן העכבר, צריך להיות מותאמות. הריכוז של dispase השנייה יכול לנוע 2.5-5 מ"ג / מיליליטר, וזמן דגירה 20-45 דקות. ההכתמה ש?...

Discussion

כאשר גיליונות אפידרמיס של עור בוגר מC57BL / 6 נגועים HSV-1 בכ -100 PFU / תא, אנו רואים זיהום כמעט בכל תאים של שכבת הבסיס באפידרמיס interfollicular בעוד מינונים נמוכים וירוס לתאם עם תאים נגועים פחות ואיטי יותר התקדמות של זיהום. באופן כללי, זקיקי שיער להראות מספר משתנה של תאים נגועים; בעו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus