Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

Resumo

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Resumo

Para introduzir o seu hospedeiro humano, vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) tem de ultrapassar a barreira de superfícies mucosas, pele e córnea. HSV-1 alvos os queratinócitos durante a entrada inicial e estabelece uma infecção primária no epitélio, que é seguida por uma infecção latente de neurónios. Após a reativação, o vírus pode tornar-se evidente em locais mucocutâneas que aparecem como vesículas ou úlceras cutâneas mucosas. Como o HSV-1 invade pele ou mucosa e atinge os seus receptores é mal compreendida. Para investigar a via de invasão de HSV-1 no tecido epidérmico, ao nível celular, estabelecemos um modelo ex vivo de infecção epiderme murino, que representa o local da infecção primária e recorrente da pele. O ensaio inclui a preparação de pele de murino. A epiderme é separada da derme por tratamento com dispase II. Depois de as folhas epidérmicas flutuante em meio contendo vírus, o tecido é fixa e a infecção pode ser visualizado em vários momentos após a infecção pelacoloração de células infectadas com um anticorpo contra o HSV-1 de proteína precoce imediata ICP0. ICP0 células que expressam podem ser observados na camada basal dos queratinócitos já em 1,5 h após a infecção. Com vezes mais longo da infecção, as células infectadas são detectados nas camadas suprabasais, indicando que a infecção não se limita aos queratinócitos basais, mas o vírus propaga-se para outras camadas no tecido. Utilizando folhas epidérmicas de vários modelos de ratinho, o protocolo de infecção permite a determinação do envolvimento de componentes celulares que contribuem para o HSV-1 no tecido invasão. Além disso, o ensaio é adequado para testar inibidores em tecidos que interferem com os passos iniciais de entrada, disseminação célula-a-célula e produção de vírus. Aqui, descrevemos o protocolo ex vivo infecção em detalhes e apresentar os nossos resultados utilizando camundongos Nectin-1- ou HVEM deficiente.

Introdução

Herpes simplex vírus (HSV) pode causar uma série de doenças em humanos de lesões mucocutâneas sem complicações leves a infecções potencialmente fatais. HSV tipo 1 (HSV-1) é predominantemente associada com infecções orofacial e encefalites, enquanto o HSV tipo 2 (HSV-2), mais provavelmente provoca infecções genitais ^1. Embora haja progressos significativos na compreensão de como HSV entra nas células em cultura, inicia a infecção e produz progênie viral, sabemos pouco sobre a via de invasão viral (s) no tecido no nível celular ^2. Para os estudos de HSV pele ou infecções das mucosas, ratinhos, coelhos e porquinhos da índia foram utilizados como modelos animais. Infecção da pele foi estabelecida por injecção intradérmica ou por raspagem da pele, na presença de vírus, e o desenvolvimento da doença foi correlacionada com a produção de vírus. Estes métodos ajudou a compreender vários aspectos da patogénese da doença, e são usados ​​para avaliar as drogas antivirais. Para estudar a infecção por HSV na tissunível e, organotípicas modelos de pele humana foram aplicados. À medida que a taxa de infecção é restrita nestas culturas jangadas, apenas um número limitado de estudos que investigam a infecção, propagação virai e os efeitos dos componentes antivirais foram publicados ^3-6.

A fim de caracterizar determinantes celulares que desempenham um papel durante a infecção por HSV-1 no epitélio intacto, foi estabelecido um protocolo ex vivo para estudos de infecção de epiderme ⁷ de murídeo. A pele foi preparada a partir de recém-nascidos ou da cauda de camundongos adultos. Uma vez que o HSV-1 não pode infectar amostras de pele completos, que foram submersas em meio contendo vírus, que separada da epiderme da derme por tratamento com dispase II. Após flutuação das folhas epidérmicas em meio contendo vírus, as células infectadas podem ser visualizados na camada basal da epiderme vários momentos após a infecção em (PI) ^7. Para visualizar a iniciação da infecção em células individuais antes da replicação de um vírusND produção de vírus, é corada com um anticorpo contra a proteína de célula infectada 0 (ICP0), que é uma das primeiras proteínas expressas durante a infecção por HSV-1. A localização celular de ICP0 passa por fases distintas durante a infecção inicial. Enquanto ICP0 está presente em focos nucleares durante a fase inicial da expressão de genes virais, relocalização de ICP0 para o citoplasma indica uma fase posterior da infecção ^8.

Utilizou-se o ensaio ex vivo infecção de folhas epidérmicas a partir de diferentes modelos de ratinho para testar o papel potencial de vários factores celulares durante a infecção. Para lidar com o impacto da Rac1 como um regulador chave da dinâmica de actina, que infectou os epiderme de camundongos portadores de deleção específicas de queratinócitos do gene rac1 ^9. Este modelo permitiu-nos estudar as consequências da deficiência Rac1 na eficiência de infecção por HSV-1 em camadas epidérmicas de queratinócitos. A comparação com epiderme infectadas da mesma ninhada de controle revealed nenhuma diferença significativa, indicando que a falta de Rac1 não teve nenhum efeito sobre o início da infecção na camada basal da epiderme ^7. O uso de mais modelos de ratos nos permitiu abordar quais os receptores celulares mediar entrada para a epiderme. Infectar folhas epidérmicas a partir de qualquer Nectin-1- ou murganhos deficientes em HVEM com o HSV-1 revelou que a entrada viral inicial no tecido depende fortemente da presença de Nectin-1 ^10. Além disso, os nossos resultados demonstram que o HVEM pode também servir como receptor de epiderme em murinos, embora de forma menos eficiente do que Nectin-1 ^10.

Para abordar a distribuição espacial de células infectadas nas camadas epidérmicas, que ICP0 visualizar a expressão em secções de tecido e as peças inteiras da epiderme (Figura 1). Em criocortes de pele completa, não há células que expressam ICP0 são detectados (Figura 1). Em contraste, criocortes de folhas epidérmicas demonstrar citoplasmáticaICP0 expressão na camada basal às 3 horas já pi (Figura 1). Em tempos mais recentes, a propagação viral camadas suprabasais pode ser visualizado. A distribuição espacial de células infectadas na camada basal pode ser facilmente seguido de pele epidérmicos em montagens inteiras (Figura 1). Após a infecção com HSV-1 a 100 UFP / célula, aproximadamente 50% dos queratinócitos basais interfoliculares na epiderme mostram expressão ICP0 em 1,5 h pi Neste ponto de tempo a maioria das células infectadas expressam ICP0 nuclear. A relocalização da ICP0 para o citoplasma, indicando uma fase posterior de expressão do gene precoce está presente em quase todas as células a 3 hr pi (Figura 1). Estes modos de visualizar as células infectadas ex vivo após a infecção por HSV-1 proporcionam um ensaio poderoso para estudar o efeito de inibidores ou de excluídos / componentes celulares mutadas para a entrada virai e disseminação no tecido.

Protocolo

Declaração de ética.

A preparação de folhas epidérmicas de animais sacrificados é realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia de Landesamt für Natur, Umwelt e Verbraucherschutz, Renânia do Norte-Vestfália (Alemanha). O estudo foi aprovado pelo LANUV NRW (Número 8.84-02.05.20.13.018).

1. Preparação de Instrumentos e Meios de Cultura

1. Cultivar folhas epidérmicas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / elevado teor de glucose contendo dipéptido glutamina, FCS a 10%, 100 IU / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina (a seguir referido como "DMEM").
2. Para a preparação de folhas epidérmicas, dissolver cuidadosamente dispase II em pó (5 mg / ml) em PBS aquecido (até 37 ° C). Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um e usá-lo directamente para tratamento.
3. Para a preparação de toda monta epidérmica ^13, preparar o bloqueio lustreer com 0,5% de leite em pó, 0,25% de gelatina de pele de peixe de água fria e 0,5% de Triton X-100 em TBS. Permitir substâncias para dissolver por incubação da mistura durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente num misturador rotativo. Também preparar 0,2% de Tween 20 em PBS como tampão de lavagem. Para a fixação, preparar 3,4% e 4% de formaldeído em PBS.
4. Para a imunocoloração de criocortes, preparar tampão de bloqueio com 5% de soro normal de cabra e 0,2% de Tween 20 em PBS. Para a fixação, preparar 0,5% de formaldeído em PBS.

2. Preparação de lâminas de epiderme da pele Murino

1. Preparação da epiderme da pele recém-nascido de volta para os estudos de infecção
   1. Coloque um rato decapitados (1 a 3 dias após o nascimento) num prato de dissecação e cortar as extremidades e a cauda perto do tronco para permitir a remoção eficiente da pele do tronco completa. Durante a remoção das extremidades, para tentar manter os cortes tão pequena quanto possível de diâmetro.
   2. Corrigir o tronco curvado com uma pinça finand mover suavemente tesoura ponta romba debaixo da pele do crânio de caudal ao longo das costas de separar a pele do tronco. Slit a pele ao longo das costas.
   3. Para a análise FACS, o isolamento dos queratinócitos ou preparação de RNA, retire a pele completa do tronco, utilizando uma pinça para fixar o tecido e as tesouras ponta romba para empurrar o torso. Para a preparação de criosecções ou peças inteiras levar apenas pedaços de pele para trás.
   4. Pique a pele para trás com um bisturi em 1-2 pedaços de aproximadamente 10 x 10 mm. Coloque as peças em um poço de uma placa de 6 poços com ~ 1 ml de PBS estéril. Certifique-se de que o lado dérmico virado para o fundo.
   5. Substituir 1,5 ml de PBS por dispase II (5 mg / ml PBS) e incubar durante 30 min quer a 37 ° C (para as peças inteiras) ou O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes com PBS. Remova cuidadosamente a epiderme como uma folha intacta usando uma pinça para fixar a derme subjacente e os outros pinça para levantar a epiderme. Use um binóculo para dar este passo easy. Transferir a folha epidérmica em DMEM com o lado basal para o fundo. Use as folhas imediatamente para experimentos de infecção.
      NOTA: Utilize a preparação da epiderme da pele recém-nascido, principalmente para análise FACS, o isolamento dos queratinócitos ou preparação de RNA. Por causa da sua fragilidade, a preparação de folhas infectadas para criossecções ou peças inteiras é menos adequado.
2. Preparação da epiderme de pele da cauda de adulto para estudos de infecção
   1. Eutanásia dos ratos com a idade de 1 a 3 meses, por deslocamento cervical. Tome cauda em vez de pele para trás uma vez que os folículos pilosos longo embutidos na parte traseira dificultar a separação de folhas epidérmicas intactas. Corte a cauda de camundongos sacrificados e cortou-o no sentido do comprimento com um bisturi.
   2. Retire a pele do osso e pique-o com um bisturi em pedaços de cerca de 5 x 5 mm. Coloque até 4 peças em um bem e prosseguir com a incubação em dispase II como descrito em 2.1.5
      NOTA: Use tai adultol pele para preparar criocortes ou peças inteiras. Como alternativa à utilização imediata, caudas pode ser armazenado ou transportado para, aproximadamente, 24 h a 4 ° C sem perda significativa de eficiência de infecção. Se caudas são mantidos até 48 horas, folhas epidérmicas poderia ser mal infectados com HSV-1.
3. A dissociação da epiderme, para a análise por FACS
   Nota: A detecção da expressão da proteína de superfície por análise de FACS requer técnicas de dissociação de células adequadas que não prejudiquem a superfície da célula e a proteína de interesse.
   1. Incubar lâminas de epiderme recém-nascidos em uma placa de 6 poços, com o lado basal em 1,5 mL / poço recombinante solução de dissociação de células de tripsina à base durante 15 min à TA e durante 15 min a 37 ° C.
   2. Parar a incubação pela adição de 3 ml de DMEM. Dissociar queratinócitos utilizando uma pinça fina curvadas para mover suavemente a epiderme na placa de 6 poços de modo a que os queratinócitos se dissolvem. Recolha a suspensão de células e repetir este passo 3 vezessempre usando DMEM fresco.
      NOTA: Este procedimento de dissociação é adequado para detectar Nectin-1 na superfície de queratinócitos.
   3. Alternativamente, as folhas epidérmicas incubar em solução de dissociação de células sem enzima (CDS) durante 15 min à temperatura ambiente e 15 min a 37 ° C. Incubar mais 15 minutos à temperatura ambiente para limpar suavemente os queratinócitos pipetando CDS cima e para baixo.
   4. Recolha a suspensão de células e repita o passo de lavagem 3 vezes com DMEM fresco.
      NOTA: Esta dissociação é adequado para detectar a expressão de superfície de HVEM. A desvantagem da solução CDS é que menos células são dissociadas com uma solução de dissociação de células recombinante baseado em tripsina. Além disso a superfície de expressão, expressão citoplasmática ou nuclear, tais como expressão ICP0 podem ser analisados ​​por SCAF após a dissociação das folhas epidérmicas infectadas com o recombinante solução de dissociação de células de tripsina à base.
4. A dissociação da epiderme para isolar queratinócitos ou exRNA trato
   1. Coloque folhas epidérmicas recém-nascidos em uma placa de 6 poços, com o lado basal para o fundo do prato que contém 1,5 ml / poço solução de dissociação de células recombinante baseado em tripsina. Incubar durante 30 min à TA. Adicionar 3 ml de DMEM e dissociar queratinócitos utilizando uma pinça fina curvadas para mover suavemente a epiderme do prato.
   2. Recolha a suspensão de células e repetir este passo 3 vezes usando fresco DMEM. Utilizar esta suspensão de células para extrair ARN ou aos queratinócitos murinos cultura primária.

3. A infecção das lâminas epidérmicas com HSV-1

1. Prepara-se uma solução de HSV-1 estirpe 17 ¹¹ em peso, em não menos de 500 ul de DMEM e substituir o meio por a solução de vírus em que as folhas epidérmicas são flutuante. Este ponto de tempo é definido como o tempo 0 ^12. Execute infecção de uma folha epidérmica em um poço de uma placa de 24 poços a 37 ° C. O cálculo do título do vírus é baseada no número estimadode células na camada basal da epiderme por folha (de aproximadamente 2 x 10 ⁵ células por folha de 5 x 5 mm).
2. Infect com o HSV-1 em cerca de 100 unidades formadoras de placas (PFU) / célula e substituir o meio contendo vírus por DMEM a 1 hr pi
   NOTA: No caso de folhas epidérmicas de pele recém-nascido, tenha em mente que as folhas começam a dissociar durante a incubação.

4. Visualização de células infectadas

1. Epidérmica Whole Mounts ¹³
   1. Fix folhas epidérmicas com 3,4% de formaldeído, quer durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C. Lavar duas vezes com PBS e bloquear com 0,5% de leite em pó, 0,25% de gelatina de pele de peixe de água fria e 0,5% de Triton X-100 em TBS durante 1 hora à TA ^14.
   2. Incubar as folhas de O / N com murganho anti-ICP0 (anticorpo monoclonal 11060) ¹⁵ diluída 1:60 em tampão de bloqueio à temperatura ambiente. Para a visualização da rede intermédia de filamentos simultaneamente incubar com anticorpo policlonal de coelho anti-rato queratina 14 (100 ng / mL).
   3. Lavar 4 a 5 vezes com PBS-Tween 20 a 0,2% durante 4 horas à temperatura ambiente. Incubar O / N com AF488-conjugado anti-IgG de ratinho (1 mg / ml), AF555-conjugado anti-IgG de coelho (1 ug / ml), e DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) (100 ng / ml) em tampão de bloqueio à temperatura ambiente.
   4. Lavar com PBS-0,2% de Tween 20, durante 4 h à TA. Folhas epidérmicas Monte com o seu lado basal em cima de uma lâmina de amostra, incorporar no meio de montagem fluorescente e cobrir com lamelas.
2. Epidérmica Cortes congelados
   1. Folhas epidérmicas mediana foram fixadas em formaldeído a 4% em PBS durante 20 min à temperatura ambiente e lavou-se 2 vezes com PBS. Folhas fixas Incorporar em tecido de congelação médio e congelamento em nitrogênio líquido. Corte 8-10 mm seções com um cryomicrotome.
   2. Fixar as secções mais uma vez com 0,5% de formaldeído em PBS durante 10 min à temperatura ambiente, lava-se 2 vezes com PBS, bloco com 5% de soro normal de cabra e 0,2% de Tween 20 em PBS durante 30 min à temperatura ambiente, e em seguida corar durante 60 min com mouse anti-ICP0 (anticorpo monoclonal 11060) ¹⁵ diluída 1:60 em tampão de bloqueio, seguido por lavagem 3 vezes com tampão de bloqueio.
   3. Em seguida incubar com anti-IgG de ratinho conjugado com AF488 (1 ug / ml) e DAPI (100 ng / ml) em tampão de bloqueio durante 45 minutos à temperatura ambiente e lava-se 3 vezes. Seções incorporar em meio de montagem fluorescente e cobrir com lamelas.

Resultados

O desafio do método é o de preparar as folhas epidérmicas em que o HSV-1 pode penetrar a partir da camada basal. O passo crítico é a separação da epiderme da derme por tratamento com dispase II, que, dependendo da estirpe de ratinho, deve ser adaptado. A concentração de dispase II pode variar de 2.5 a 5 mg / ml, e o tempo de incubação de 20 a 45 min. A coloração da proteína de filamento intermediário queratina 14 permite prever prontamente se a camada basal da epiderme pode ser infectado ou se irá mostra...

Discussão

Quando as folhas epidérmicas da pele de um adulto de ratinhos C57BL / 6 são infectadas com HSV-1 em cerca de 100 PFU / célula, observa-se infecção em quase todas as células da camada basal da epiderme interfoliculares enquanto que doses de vírus mais baixos correlacionam-se com as células menos infectados e um mais lento o progresso da infecção. Em geral, os folículos de cabelo mostram um número variável de células infectadas; enquanto a maioria dos queratinócitos bastante pequenas que revestem os folícu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus