Ex Vivo Infección de murino Epidermis con virus herpes simplex tipo 1

Resumen

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Resumen

Para entrar en su huésped humano, virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) debe superar la barrera de la mucosa superficies, la piel o córnea. HSV-1 Objetivos queratinocitos durante la entrada inicial y establece una infección primaria en el epitelio, que es seguido por la infección latente de las neuronas. Después de la reactivación, los virus pueden ser evidentes en los sitios de mucocutáneas que aparecen como vesículas en la piel o úlceras de la mucosa. Cómo HSV-1 invade la piel o la mucosa y llega a sus receptores es poco conocido. Para investigar la ruta invasión de HSV-1 en el tejido epidérmico en el nivel celular, se estableció un modelo ex vivo de la infección epidermis murino, que representa el sitio de la infección primaria y recurrente en la piel. El ensayo incluye la preparación de la piel murina. La epidermis se separa de la dermis mediante el tratamiento dispasa II. Después de que las láminas epidérmicas que flota en el medio que contiene el virus, el tejido es fija y la infección puede ser visualizado en diversos momentos después de la infección portinción de las células infectadas con un anticuerpo contra el HSV-1 ICP0 proteína inmediata temprana. -Expresión de ICP0 células se puede observar en la capa basal de queratinocitos ya en 1,5 hr después de la infección. Con tiempos más largos de infección, las células infectadas se detectan en las capas suprabasales, lo que indica que la infección no se limita a los queratinocitos basales, pero el virus se propaga a otras capas en el tejido. El uso de láminas epidérmicas de varios modelos de ratón, el protocolo de la infección permite la determinación de la implicación de los componentes celulares que contribuyen a HSV-1 invasión en el tejido. Además, el ensayo es adecuado para poner a prueba inhibidores en el tejido que interfieren con los pasos iniciales de entrada, propagación de célula a célula y la producción de virus. Aquí se describe el protocolo ex vivo infección en detalle y presentamos nuestros resultados utilizando ratones nectin-1- o Hvem deficiente.

Introducción

El virus del herpes simple (VHS) puede causar una serie de enfermedades en los seres humanos a partir de lesiones mucocutáneas sin complicaciones leves a las infecciones que amenazan la vida. HSV tipo 1 (HSV-1) está predominantemente asociado con las infecciones orofaciales y la encefalitis, mientras que HSV tipo 2 (HSV-2) más probable causa infecciones genitales ^1. Si bien hay un avance significativo en la comprensión de cómo el VHS entra en las células en cultivo, se inicia la infección y produce progenie viral, sabemos poco sobre la vía viral invasión (s) en el tejido a nivel celular ^2. Para los estudios de la piel HSV o infecciones de las mucosas, ratones, conejos y cobayas se han utilizado como modelos animales. Infección de la piel fue establecida por la inyección intradérmica o por el rascado de la piel en la presencia de virus, y desarrollo de la enfermedad se correlacionó con la producción de virus. Estos métodos ayudaron a entender varios aspectos de la patogénesis de la enfermedad, y se utilizan para evaluar fármacos antivirales. Para estudiar la infección por HSV en el tissuNivel E, se han aplicado modelos de piel humana organotípicos. A medida que la tasa de infección está restringida de estas culturas balsa, sólo un número limitado de estudios de investigación de la infección, propagación viral y los efectos de los componentes antivirales han sido publicados ^3-6.

Para caracterizar determinantes celulares que juegan un papel en la infección por HSV-1 en el epitelio intacto, hemos establecido un protocolo para estudios ex vivo de infección de la epidermis murinos ^7. Se preparó a partir de la piel recién nacidos o de las colas de ratones adultos. Desde HSV-1 no podía infectar muestras de piel completas, que fueron sumergidos en un medio que contiene el virus, separamos la epidermis de la dermis mediante el tratamiento dispasa II. Después de flotación de las hojas epidérmicas en un medio que contiene el virus, las células infectadas se pueden visualizar en la capa basal de la epidermis en las varias horas después de la infección (pi) ^7. Para visualizar el inicio de la infección en las células individuales antes de la replicación viral de unand producción de virus, se tiñeron con un anticuerpo contra la proteína de las células infectadas 0 (ICP0), que es una de las primeras proteínas expresadas durante HSV-1 infección. La localización celular de ICP0 pasa a través de fases distintas durante la infección temprana. Mientras ICP0 está presente en focos nucleares durante una etapa temprana de la expresión génica viral, relocalización de ICP0 al citoplasma indica una fase posterior de la infección ^8.

Se utilizó el ensayo ex vivo infección de láminas epidérmicas de diferentes modelos de ratón para probar el papel potencial de diversos factores celulares durante la infección. Para hacer frente al impacto de Rac1 como un regulador clave de la dinámica de la actina, estamos infectados la epidermis de ratones con una deleción-queratinocitos específica del gen Rac1 ^9. Este modelo nos permitió estudiar las consecuencias de la deficiencia de Rac1 en la eficiencia de HSV-1 infección en capas de queratinocitos epidérmicos. La comparación con la epidermis infectados de camada de control rerevelado ninguna diferencia significativa, lo que indica que la ausencia de Rac1 no tuvo efecto sobre la iniciación de la infección en la capa basal de la epidermis ^7. El uso de otros modelos de ratón nos ha permitido abordar la cual los receptores celulares median entrada en la epidermis. La infección de láminas epidérmicas de cualquiera nectin-1- o ratones deficientes en Hvem con HSV-1 reveló que la entrada viral inicial en el tejido depende fuertemente de la presencia de nectin-1 ^10. Además, nuestros resultados demuestran que Hvem también puede servir como receptor en la epidermis murinos, aunque menos eficiente que nectin-1 ^10.

Para hacer frente a la distribución espacial de las células infectadas en las capas epidérmicas, visualizamos expresión ICP0 en secciones de tejido y los montajes enteros epidérmico (Figura 1). En cryosections de piel completa, no hay células que expresan ICP0 se detectan (Figura 1). En contraste, cryosections de láminas epidérmicas demuestran citoplásmicaICP0 expresión en la capa basal ya a las 3 horas pi (Figura 1). En épocas posteriores, virus se propague a suprabasal capas se puede visualizar. La distribución espacial de las células infectadas en la capa basal se puede seguir fácilmente en preparaciones completas epidérmico (Figura 1). Tras la infección con HSV-1 en 100 PFU / célula, aproximadamente el 50% de los queratinocitos basales de la epidermis interfolicular muestran expresión ICP0 en 1,5 hr pi En este punto de tiempo de las células infectadas expresan más ICP0 nuclear. La relocalización de ICP0 al citoplasma que indica una etapa posterior de la expresión génica temprana está presente en casi todas las células en 3 pi hr (Figura 1). Estos modos de visualización de las células infectadas ex vivo sobre HSV-1 infección proporcionan un poderoso ensayo para estudiar el efecto de los inhibidores o de componentes celulares mutados eliminados / en la entrada viral y la propagación en el tejido.

Protocolo

Declaración de Ética.

La preparación de láminas epidérmicas de los animales sacrificados se lleva a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía de Landesamt für Natur, Umwelt y Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia (Alemania). El estudio fue aprobado por LANUV NRW (Número 8.84-02.05.20.13.018).

1. Preparación de los instrumentos y medios de cultivo

1. Cultivar láminas epidérmicas en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / alto contenido de glucosa que contiene dipéptido glutamina, 10% de FCS, 100 IU / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina (denominado en lo sucesivo "DMEM").
2. Para la preparación de láminas epidérmicas, disolver cuidadosamente dispasa II polvo (5 mg / ml) en PBS climatizada (hasta 37 ° C). Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 micras y utilizarlo directamente para el tratamiento.
3. Para la preparación de toda epidérmica monta ^13, el bloqueo de buff prepararer con 0,5% de leche en polvo, 0,25% de gelatina de piel de pescado de agua fría y 0,5% de Triton X-100 en TBS. Permitir que las sustancias se disuelvan mediante la incubación de la mezcla durante al menos 2 horas a RT en un mezclador giratorio. También hay que preparar 0,2% de Tween 20 en PBS como tampón de lavado. Para la fijación, preparar 3,4% y 4% de formaldehído en PBS.
4. Para la inmunotinción de criosecciones, preparar tampón de bloqueo con 5% de suero normal de cabra y 0.2% Tween 20 en PBS. Para la fijación, preparar 0,5% de formaldehído en PBS.

2. Preparación de láminas epidérmicas de la piel murina

1. Preparación de la epidermis de la piel de la espalda del recién nacido para los estudios de infección
   1. Coloque un ratón decapitado (1 a 3 días después del nacimiento) en un plato de disección y cortar las extremidades y la cola cerca del torso para permitir la eliminación eficaz de la piel contra el torso completo. Durante la eliminación de las extremidades, trate de mantener los recortes lo más pequeña posible de diámetro.
   2. Fijar el torso con curva pinzas finas unnd mueva suavemente tijeras de punta roma debajo de la piel de craneal a caudal a lo largo de la espalda para separar la piel del torso. Corte la piel a lo largo de la parte posterior.
   3. Para el análisis FACS, el aislamiento de los queratinocitos o preparación de ARN, pelar la piel completa del torso utilizando pinzas para fijar el tejido y las tijeras de punta roma para empujar el torso. Para la preparación de cryosections o montajes enteros tomar sólo piezas de la piel de la espalda.
   4. Picar la piel de la espalda con un bisturí en 1-2 trozos de aproximadamente 10 x 10 mm. Ponga los pedazos en un pocillo de una placa de 6 pocillos con ~ 1 ml de PBS estéril. Asegúrese de que el lado dérmico se enfrenta a la parte inferior.
   5. Reemplace PBS por 1,5 ml de dispasa II (5 mg / ml de PBS) y se incuba durante cualquiera de 30 minutos a 37 ° C (para montajes enteros) o O / N a 4 ° C. Lavar 3 veces con PBS. Retire suavemente la epidermis como una hoja intacta usando uno pinzas para fijar la dermis subyacente y las otras pinzas para levantar la epidermis. Utilice un binocular para hacer este paso easy. La transferencia de la hoja epidérmica en DMEM con su lado basal hacia la parte inferior. Utilice las hojas de inmediato para experimentos de infección.
      NOTA: Utilice la preparación de la epidermis de la piel del recién nacido principalmente para el análisis FACS, el aislamiento de los queratinocitos o preparación de ARN. Debido a su fragilidad, la preparación de hojas infectadas de cryosections o montajes enteros es menos adecuado.
2. Preparación de la epidermis de la piel de la cola de adultos para estudios de infección
   1. La eutanasia a los ratones a la edad de 1 a 3 meses por dislocación cervical. Tome la cola en lugar de piel de la espalda ya que los folículos del pelo largo incrustados en la parte posterior dificultan la separación de láminas epidérmicas intactas. Cortar la cola de los ratones sacrificados y raja longitudinalmente con un bisturí.
   2. Despegar la piel del hueso y cortar con un bisturí en trozos de unos 5 x 5 mm. Ponga hasta 4 piezas en un solo bien y proceder a la incubación en dispasa II como se describe en 2.1.5
      NOTA: El uso del tai adultosl piel para preparar cryosections o montajes enteros. Como alternativa a la utilización inmediata, las colas pueden ser almacenados o transportados por aproximadamente 24 horas a 4 ° C sin perder eficiencia de infección significativo. Si sale cruz se mantienen hasta 48 horas, láminas epidérmicas podrían apenas infectadas con HSV-1.
3. La disociación de la epidermis para el análisis FACS
   NOTA: La detección de la superficie de la proteína de expresión por análisis FACS requiere técnicas de disociación de células apropiadas que no dañan la superficie celular y la proteína de interés.
   1. Incubar láminas epidérmicas recién nacido en una placa de 6 pocillos con la parte basal de 1,5 ml / solución de disociación celular bien recombinante basado en tripsina durante 15 min a TA y durante 15 min a 37 ° C.
   2. Detener la incubación mediante la adición de 3 ml de DMEM. Disociar queratinocitos utilizando una curva pinzas finas para mover suavemente la epidermis de la placa de 6 pocillos para que los queratinocitos se disuelven. Recoger la suspensión celular y repita este paso 3 vecessiempre utilizando DMEM fresco.
      NOTA: Este procedimiento de disociación es adecuada para detectar nectin-1 en la superficie de los queratinocitos.
   3. Alternativamente, se incuban las láminas epidérmicas en solución de disociación celular libre de enzimas (CDS) durante 15 min a RT y 15 min a 37 ° C. Incubar otros 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar suavemente los queratinocitos pipeteando CDS arriba y hacia abajo.
   4. Recoger la suspensión de células y repetir el paso de lavado 3 veces utilizando DMEM fresco.
      NOTA: Esta disociación es adecuada para detectar la expresión superficial de Hvem. La desventaja de la solución CDS es que menos células se disocian con una solución de disociación celular a base de tripsina recombinante. Además de la superficie expresión, expresión nuclear o citoplásmica tal como la expresión ICP0 se puede analizar por FACS después de la disociación de las láminas epidérmicas infectados con solución de disociación celular a base de tripsina recombinante.
4. La disociación de la epidermis para aislar queratinocitos o exARN del tracto
   1. Ponga láminas epidérmicas recién nacidos en una placa de 6 pocillos con el lado basal hacia el fondo del plato, que contiene 1,5 ml / solución de disociación celular a base de tripsina bien recombinante. Incubar durante 30 min a TA. Añadir 3 ml de DMEM y disociar los queratinocitos utilizando un curvadas unas pinzas finas para mover suavemente la epidermis en el plato.
   2. Recoger la suspensión celular y repita este paso 3 veces con DMEM fresco. Utilice esta suspensión de células para extraer el ARN o a los queratinocitos murinos cultivo primario.

3. La infección de las láminas epidérmicas con HSV-1

1. Preparar una solución de HSV-1 cepa en peso 17 ¹¹ en no menos de 500 l DMEM y reemplazar el medio por la solución de virus en la que las láminas epidérmicas están flotando. Este punto de tiempo se define como tiempo 0 ^12. Efectuar la infección de una hoja epidérmica en un pocillo de una placa de 24 pocillos a 37 ° C. El cálculo de la concentración de virus se basa en el número estimadode las células en la capa basal epidérmica por hoja (aproximadamente 2 x 10 ⁵ células por 5 x 5 mm hoja).
2. Infectar con HSV-1 a aproximadamente 100 unidades formadoras de placa (UFP) / célula y reemplazar el medio que contiene el virus por DMEM a 1 hr pi
   NOTA: En caso de láminas epidérmicas de la piel del recién nacido, tenga en cuenta que las hojas comienzan a disociarse durante la incubación.

4. Visualización de las células infectadas

1. Epidérmico Whole Mounts ¹³
   1. Fijar láminas epidérmicas con 3,4% de formaldehído o bien durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Lavar dos veces con PBS y bloquear con 0,5% de leche en polvo, 0,25% de gelatina de piel de pescado de agua fría y 0,5% de Triton X-100 en TBS durante 1 h a RT ^14.
   2. Incubar las hojas de O / N con el ratón anti-ICP0 (anticuerpo monoclonal 11060) ¹⁵ diluido 1:60 en tampón de bloqueo a temperatura ambiente. Para visualizar el red de filamentos intermedios se incuba simultáneamente con policlonal de conejo anti-queratina ratón 14 (100 ng / ml).
   3. Lavar 4 a 5 veces con PBS-Tween 20 0,2% durante 4 horas a RT. Incubar O / N con AF488-conjugado anti-IgG de ratón (1 mg / ml), IgG anti-conejo-AF555 conjugado (1 mg / ml), y DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) (100 ng / ml) en tampón de bloqueo a temperatura ambiente.
   4. Lavar con PBS-Tween 20 0,2% durante 4 horas a RT. Láminas epidérmicas de montaje con su parte basal en la parte superior de un portaobjetos, incrustar en medio de montaje fluorescente y cubren con cubreobjetos.
2. Epidérmico criosecciones
   1. Láminas epidérmicas adultos fueron fijadas en formaldehído al 4% en PBS durante 20 min a TA y se lavaron 2 veces con PBS. Hojas fijas Insertar en el tejido medio de congelación y congelación en nitrógeno líquido. Cortar 8-10 micras secciones con un criomicrotomo.
   2. Fijar las secciones de nuevo con 0,5% de formaldehído en PBS durante 10 min a TA, se lava 2 veces con PBS, bloque con 5% de suero normal de cabra y 0.2% Tween 20 en PBS durante 30 min a TA, y luego manchar durante 60 min con mouse anti-ICP0 (anticuerpo monoclonal 11060) ¹⁵ diluido 1:60 en tampón de bloqueo, seguido de lavado 3 veces con el tampón de bloqueo.
   3. A continuación, se incuba con AF488-conjugado anti-IgG de ratón (1 mg / ml) y DAPI (100 ng / ml) en tampón de bloqueo durante 45 min a TA y lavar 3 veces. Insertar secciones en medio de montaje fluorescente y cubrir con cubreobjetos.

Resultados

El reto del método es para preparar láminas epidérmicas en el que HSV-1 puede penetrar desde la capa basal. El paso crítico es la separación de la epidermis de la dermis mediante el tratamiento dispasa II, que, dependiendo de la cepa de ratón, necesita ser adaptado. La concentración de dispasa II puede variar de 2,5 a 5 mg / ml, y el tiempo de incubación de 20 a 45 min. La tinción de la proteína de filamentos intermedios de queratina 14 permite fácilmente predecir si la capa epidérmica basal puede estar infe...

Discusión

Cuando las hojas epidérmicas de la piel del adulto de ratones C57BL / 6 están infectadas con HSV-1 a aproximadamente 100 UFP / célula, se observa infección en casi todas las células de la capa basal en la epidermis interfolicular mientras que las dosis de virus más bajos se correlacionan con células menos infectados y una más lenta el progreso de la infección. En general, los folículos pilosos muestran un número variable de células infectadas; mientras que la mayoría de los más pequeños queratinocitos que...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus