Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

Özet

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Özet

Insan ana girmek için, herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1), mukoza yüzeyleri, deri ya da kornea engeli aşmak gerekir. HSV-1 hedefleri ilk girişi sırasında keratinositler ve nöronların latent enfeksiyon takip eder epitel, bir ilköğretim enfeksiyon oluşturur. Reaktivasyonu sonra, virüsler deri veya mukozal ülserler veziküller olarak görünür mukokutanöz sitelerde belirgin hale gelebilir. HSV-1 deri veya mukoza işgal ve ulaştığı Nasıl onun reseptörleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel düzeyde epidermal doku içine HSV-1 işgali rota araştırmak için, deride primer ve tekrarlayan enfeksiyon siteyi temsil eden fare epidermisin bir ex vivo enfeksiyon modeli kurdu. Tahlil fare deri hazırlanmasını içermektedir. Epidermis dispaz II muamele ile dermis ayrılır. Virüs içeren ortam üzerinde epidermal yüzer tabaka sonra, doku sabittir ve enfeksiyonunun çeşitli zamanlarda İnokulasyonu de görselleştirilebilirHSV-1-erken proteini ICP0 karşı bir antikor ile enfekte olmuş hücrelerin boyanması. ICP0 sentezleyen hücrelerin 1,5 saat İnokulasyonu zaten bazal keratinosit tabakada gözlenebilir. Uzun enfeksiyon süreleri ile enfekte olan hücreleri enfeksiyon bazal keratinositler sınırlı, ancak virüs dokusunda diğer katmanlarına yayılır olmadığını belirten suprabazal katmanlarında tespit edilir. Çeşitli fare modellerinin epidermal sayfaları kullanarak, enfeksiyon protokolü dokusu içine HSV-1 işgali katkıda hücresel bileşenlerin katılımı belirleyen verir. Ek olarak, analiz, ilk giriş adımları müdahale doku inhibitörleri, hücre-hücre yayılması ve virüs üretimini test etmek için uygundur. Burada, detaylı ex vivo enfeksiyon protokol açıklar ve adiponektin-1- veya HVEM eksik fareler kullanarak sonuçlarını sunmak.

Giriş

Herpes simpleks virüsü (HSV) yaşamı tehdit eden enfeksiyonların hafif komplike deri ve mukoza lezyonları, insanlarda çeşitli hastalıklara yol açabilir. HSV tip 1 (HSV-1), baskın olarak daha çok genital enfeksiyonlar ¹ neden HSV tip 2 (HSV-2) ise, orofasyal enfeksiyonlar ve ensefalit ile ilişkilidir. HSV, kültür hücreleri girer enfeksiyon başlatır ve viral döl üreten nasıl anlaşılmasında önemli bir ilerleme olsa da, biz hücresel düzeyde ^2'de doku içine viral invazyonu yolunun (ler) hakkında çok az şey biliyoruz. HSV deri ya da mukoza enfeksiyonu, farelerin çalışmaları için, tavşan ve gine domuzları, hayvan modelleri olarak kullanılmıştır. Cilt enfeksiyonu intradermal enjeksiyonu ile veya virüs varlığında cilt çizilmemesi tarafından kurulmuş ve hastalık gelişimi virüs üretimi ile ilişkili olduğu saptandı. Bu yöntemler hastalığın patogenezinde çeşitli yönlerini anlamasına yardım ve antiviral ilaçlar değerlendirmek için kullanılır. Tissu'nun HSV enfeksiyonu araştırmake düzeyi organotipik insan derisi modelleri uygulanmıştır. Enfeksiyon oranı, bu Sal kültürlerinde sınırlıdır gibi, enfeksiyon, viral yayılmayı çok çalışma yapılmış ve antiviral bileşenlerin etkileri sadece sınırlı sayıda ^3-6 yayınlanmıştır.

Sağlam epitel HSV-1 enfeksiyon esnasında bir rol oynayabilir, hücresel belirleyicilerini karakterize etmek için, sıçangil epidermis ⁷ ex vivo enfeksiyon çalışmalar için bir protokol kurulmuştur. Cilt yenidoğan veya yetişkin farelerin kuyrukları hazırlandı. HSV-1 virüsü içeren bir ortamda batık bulundu komple deri örnekleri, enfekte olabilir bu yana, biz dispase II muamele ile epidermis, dermis ayrılmış. Virüs içeren ortam üzerinde epidermal tabakaların kayan sonra, enfekte olmuş hücreler, çeşitli katı İnokulasyonu (pi) ⁷ de epidermal bazal tabakasında, görüntülenebilir. Viral replikasyon a önce tek tek hücrelerin enfeksiyonunun başlamasını görselleştirmek içinnd virüs üretimi, HSV-1 enfeksiyon sırasında ifade edilen ilk proteinlerden biridir enfekte hücre proteini 0 (ICP0) karşı bir antikorla boyanmıştır. ICP0 hücresel lokalizasyonu, erken enfeksiyon sırasında farklı faz geçer. ICP0 viral gen ifadesinin erken aşamasında, nükleer odaklarda mevcut iken, sitoplazma ICP0 bir yerelleştirme enfeksiyonu ⁸ müteakip bir faz gösterir.

Biz enfeksiyon sırasında çeşitli hücresel faktörlerin potansiyel rolünü test etmek için farklı fare modelleri epidermal yaprak ex vivo enfeksiyon deneyi kullanıldı. Aktin dinamiklerinin önemli bir regülatör olarak Rac1 etkisini gidermek için, biz Rac1 gen ⁹ bir keratinosit özgü silinmesi ile farelerin epidermis bulaşmış. Bu model epidermal keratinosit katmanları HSV-1 enfeksiyonu verimliliği üzerinde eksik Rac1 sonuçlarını incelemek için bize izin verdi. Yeniden kontrol littermates enfekte epidermis karşılaştırmaRac1 olmaması epidermis ⁷ bazal tabakasında enfeksiyonun başlaması üzerinde etki gösteren, anlamlı bir fark bozukluk saptanmadı. Daha fazla fare modellerinin kullanımı bize hücresel reseptörler epidermis içine girişini arabuluculuk hangi adrese izin verdi. HSV-1 ile adiponektin-1- ya da HVEM-eksikliği olan farelerde birinden epidermal yaprak bulaşmasını doku içine ilk viral girişi güçlü adiponektin-1 ¹⁰ varlığına bağlıdır olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, sonuçlar, aynı zamanda HVEM adiponektin-1 ¹⁰ kadar verimli değildir, sıçangil epidermiste reseptör olarak görev yapabilir göstermektedir.

Epidermal katmanlar durumunda enfekte olan hücreler uzamsal dağılımını çözmek için, doku bölümleri ve epidermal bütün tamponla (Şekil 1) ICP0 tanımının görüntülenmesi. Tüm deri cryosections, hiçbir ICP0-ifade eden hücreler (Şekil 1) tespit edilir. Bunun aksine, epidermal tabakaların cryosections sitoplazmik göstermektedirZaten 3 saat pi (Şekil 1) bazal tabakada ICP0 ifade. Daha sonra zamanlarda, viral görüntülenebilir katmanları suprabazal yayılma. Bazal tabakasında enfekte hücrelerin mekansal dağılımı kolayca epidermal bütün bağlar (Şekil 1) takip edilebilir. HSV-1 100 PFU / hücre de enfeksiyon üzerine, interfolliküler epidermisin bazal keratinositlerin yaklaşık olarak% 50 bir çok enfekte hücreleri nükleer ICP0 ifade Bu zaman noktasında 1.5 saat pi de ICP0 ekspresyonunu göstermektedir. Erken gen ekspresyonunun daha sonraki bir aşamaya işaret sitoplazmaya ICP0 bir yerelleştirme 3 saat pi (Şekil 1) hemen hemen bütün hücrelerde bulunur. Ex vivo HSV-1 enfeksiyonu üzerine bulaşmış hücrelerin görselleştirme Bu modlar inhibitörleri veya doku viral girişi ve yayılması / silinmiş mutasyona uğramış hücre bileşenlerinin etkisini araştırmak için güçlü bir tahlil sağlar.

Protokol

Etik bildirimi.

Kurban hayvanlardan epidermal tabakaların hazırlanması Landesamt für Natur, Umwelt ve Verbraucherschutz, Northrhine-Vestfalya (Almanya) ve Kılavuz önerileri ile tam uyum içinde yürütülür. Çalışma LANUV NRW (Sayı 8.84-02.05.20.13.018) tarafından onaylanmıştır.

Göstergeler ve Kültür Medya 1. Hazırlık

1. Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) / yüksek glukozlu glutamin dipeptid,% 10 FCS, 100 lU / ml penisilin içeren ve / ml streptomisin, 100 ug (bundan sonra "DMEM" olarak anılacaktır), epidermal yaprak geliştirin.
2. Epidermal tabakaların hazırlanması için, dikkatli bir şekilde ısıtılmış PBS (kadar 37 ° C) 'de dispaz II tozu (5 mg / ml) çözülür. 0.22 um'lik bir filtreden filtre edin ve solüsyonu tedavisi için doğrudan kullanılır.
3. Epidermal bütün hazırlanması ¹³ bağlar için, buff bloke hazırlanması% 0.5 süt tozu, soğuk su balıkları deri ve TBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile% 0.25 jelatin ile er. Maddeler bir döner mikser üzerinde oda sıcaklığında en az 2 saat süre ile kuluçkaya bırakılması ve erimesine izin verir. Ayrıca yıkama tamponu gibi PBS içinde Tween 20% 0.2 hazırlar. Tespit için,% 3.4 ve PBS içinde% 4 formaldehit hazırlar.
4. Cryosections immün için,% 5 normal keçi serumu ve% 0.2 Tween 20, PBS tamponu ile bloke hazırlar. Tespit için, PBS içinde% 0.5 Formaldehit hazırlar.

Fare Skin gelen Epidermal Levhaların 2. Hazırlık

1. Enfeksiyon çalışmaları için yeni doğan arka deri epidermis hazırlanması
   1. Bir diseksiyon çanak içine bir decapitated fare (1 ila 3 gün doğumdan sonra) yerleştirin ve ekstremitelerde kesti ve gövde yakın kuyruk tam gövde derinin etkili kaldırılmasını sağlamak için. Ekstremite kaldırılması sırasında, çapı mümkün olduğunca küçük kesikler tutmaya çalışın.
   2. Kavisli ince forseps a ile gövde Fixyavaşça gövdeden cilt ayırmak için sırt boyunca kaudal kafatasın deri altına künt uçlu makas hareket nd. Sırt boyunca cildi kesti.
   3. FACS analizi, keratinositlerin veya RNA hazırlanması izolasyonu için gövde itmek doku ve kör uç makas düzeltmek için forseps kullanarak gövde komple deri soyulabilir. Cryosections veya tüm bağlar hazırlanması için arka cilt sadece parçalara ayırın.
   4. Yaklaşık 10 x 10 mm 1-2 parçaya bir neşter ile arka cilt doğrayın. ~ 1 ml steril PBS ile 6 oyuklu plakanın bir kuyuda parçaları koyun. Dermal tarafı dibe baktığından emin olun.
   5. 1.5 mi dispase II (5 mg / ml PBS) ile PBS yerine yerleştirin ve 4 ° C / 30 (tam araç için olan) 37 ° C'de min veya O biri için N inkübe edin. 3 kez PBS ile yıkayın. Yavaşça epidermisin kaldırmaya yatan dermis ve diğer forseps düzeltmek için bir forseps kullanarak bozulmamış levha olarak epidermis kaldırın. Bu adımı EAS yapmak için bir Dürbünü kullanıny. Alt yönelik bazal tarafı ile DMEM içine epidermal sayfasını aktarın. Enfeksiyon deneyler için hemen yapraklarını kullanın.
      Not: özellikle, FACS analizi, keratinositlerin veya RNA hazırlanması izolasyonu için yeni doğmuş deriden epidermis hazırlanmasını kullanın. Nedeniyle kırılganlık, cryosections veya bütün araç için olan enfekte edilmiş tabakaların hazırlanması daha az uygundur.
2. Enfeksiyon çalışmaları için yetişkin kuyruk ciltten epidermis hazırlanması
   1. Servikal dislokasyon ile 1 ila 3 aylıkken fareler Euthanize. Sırtında uzun gömülü saç folikülleri bozulmamış epidermal yaprak ayrılmasını engelleyen beri yerine arka cilt kuyruk alın. Kurban farelerden alınan kuyruk kesti ve bir neşter ile uzunlamasına onu yarık.
   2. Kemikten deri soyulabilir ve yaklaşık 5 x 5 mm parçalar halinde bir neşter ile doğrayın. Tek kuyuda 4 adet koyun ve 2.1.5 bölümünde anlatıldığı gibi dispase II inkübasyon devam
      NOT: yetişkin tail deri cryosections veya tüm bağlar hazırlamak. Seçenek olarak acil kullanım için, kuyruk depolanmış ya da önemli enfeksiyonun etkinliğini kaybetmeden 4 ° C'de yaklaşık 24 saat süre ile nakledilebilir. Kuyrukları 48 saat kadar tutulur ise, epidermal yaprak pek HSV-1 ile enfekte olabilir.
3. FACS analizi için, epidermisin ayrışma
   Not: FACS analizi ile yüzey proteini ifade Algılama hücre yüzeyi ile ilgili proteini zarar vermeyen uygun bir hücre ayrışma teknikleri gerektirir.
   1. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1.5 ml / oyuk rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca taban yüzü, bir 6-yuvalı plaka içinde yeni doğmuş epidermal yaprak inkübe edin.
   2. 3 ml DMEM ekleyerek inkübasyon durdurun. Keratinositler çözülmüş olsun şekilde hafifçe 6-çukurlu plaka içindeki epidermis taşımak için kavisli bir ince forseps kullanılarak keratinositler ayrıştırmaları. Hücre süspansiyonu toplayın ve bu adımı 3 kez tekrarlayınher zaman taze DMEM kullanarak.
      NOT: Bu ayrılma işlemi keratinositlerin yüzeyinde adiponektin-1 tespit etmek için uygundur.
   3. Seçenek olarak ise, oda sıcaklığında 15 dakika ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca enzimsiz hücre ayrışma çözeltisi epidermal yaprak (CDS) inkübe edilir. Yavaşça yukarı ve aşağı CDS pipetleme keratinositler dışarı floş oda sıcaklığında 15 dakika inkübe başka.
   4. Hücre süspansiyonu toplayın ve taze DMEM kullanılarak yıkama adımı 3 kez tekrarlayın.
      NOT: Bu ayrılma HVEM yüzey ekspresyonunu tespit etmek için uygundur. CDS çözümün dezavantajı daha az hücre rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi ile daha ayrışmış olmasıdır. Buna ek olarak, rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi ile enfekte epidermal tabakaların disosiasyon sonra sentezleme gibi ICP0 ifadesi olarak çekirdek ya da sitoplazmik sentezlenmesi FACS ile analiz edilebilir yüzey.
4. Epidermisin Ayrılma keratinositler veya ex izole etmekyolu RNA
   1. 1,5 ml / oyuk rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi içeren çanak tabanına doğru taban yüzü, bir 6-yuvalı plaka içinde yeni doğmuş epidermal yaprak koyun. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. 3 ml DMEM ekleyin ve hafifçe çanak epidermis taşımak için kavisli ince forseps kullanarak keratinositler ayırmak.
   2. Hücre süspansiyonu toplayın ve taze DMEM kullanarak bu adımı 3 kez tekrarlayın. RNA veya kültür birincil fare keratinositlere ayıklamak için bu hücre süspansiyonu kullanın.

HSV-1 ile epidermal Levhaların 3. Enfeksiyon

1. 500 ul DMEM daha az HSV-1 ağırlık suşu 17 ¹¹ içeren bir çözelti hazırlanması ve epidermal tabakalar kayan olan virüs çözeltisi orta yerine. Bu zaman noktası, zaman 0 ¹² olarak tanımlanır. 37 ° C'de 24 oyuklu plakanın bir kuyuda bir epidermal tabakasının enfeksiyonu gerçekleştirin. Virüs titresi hesaplanması tahmini sayısına dayanırepidermal tabaka başına taban tabakadaki hücrelerin (yaklaşık olarak 5 x 5 mm levha başına 2 x 10 ⁵ hücre).
2. HSV-1, yaklaşık 100 plak oluşturucu birimler (PFU) / hücre ile enfekte ve sonra 1 saat pi de DMEM virüs içeren ortam yerine
   NOT: Yenidoğan cilt epidermal yaprak durumunda, yaprak inkübasyon sırasında ayırmak başlar unutmayın.

Enfekte hücreler 4. Görselleştirme

1. Epidermal Tüm Mounts ¹³
   1. % 3.4 formaldehid, 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat süre ile epidermal yaprak sabitleyin. PBS ile iki kez yıkanır ve% 0.5 süt tozu, soğuk su balıkları deri ve oda sıcaklığında ¹⁴ 1 saat boyunca, TBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile% 0.25 jelatin ile bloklayın.
   2. ^15, oda sıcaklığında bloke edici tampon içinde 1:60 oranında seyreltilen fare anti-ICP0 (monoklonal antikor 11.060) sahip levhalar O / N inkübe edin. Ara filaman ağını görselleştirmek için tavşan poliklonal ile eş zamanlı olarak kuluçkaya antiFare keratin 14 (100 ng / ml).
   3. Oda sıcaklığında 4 saat boyunca PBS% 0.2 Tween 20 ile 4 ila 5 kez yıkayın. O / N AF488 konjuge edilmiş anti-fare IgG (1 ug / ml), AF555-konjüge edilmiş anti-tavşan IgG (1 ug / ml) ve DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) (100 ng inkübe oda sıcaklığında bloke edici tampon içinde / ml).
   4. Oda sıcaklığında 4 saat boyunca PBS% 0.2 Tween 20 ile yıka. Bir örnek slayt üstünde bazal tarafı Mount epidermal yaprak, floresan montaj orta embed ve lamelleri ile kaplayın.
2. Epidermal Cryosections
   1. Yetişkin epidermal tabakalar oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit içinde sabitleştirildi, PBS ile 2 kez yıkanmıştır. Dokuda göm sabit levhalar sıvı azot içinde orta ve donma donma. Bir cryomicrotome ile 8-10 mikron bölümleri kesin.
   2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Formaldehit ile tekrar bölümler saptamak PBS, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 5 normal keçi serumu ve% 0.2 Tween 20 ile blok ile 2 kez yıkanır ve daha sonra m, 60 dakika boyunca lekeAnti-ICP0 (monoklonal antikor 11.060) ¹⁵ bloke edici tampon ile yıkanarak 3 kez, ardından bloke tamponu içinde 1:60 seyreltilmiş OUSE.
   3. Daha sonra oda sıcaklığında, 45 dakika süre ile blokaj tamponu AF488 konjuge edilmiş anti-fare IgG (1 ug / ml) ve DAPI (100 ng / ml) ile inkübe edilir ve 3 kez yıkayın. Floresan montaj orta bölümleri göm ve lamelleri ile kaplayın.

Sonuçlar

Yöntemin meydan HSV-1 bazal tabakadan nüfuz içine epidermal yaprak hazırlamaktır. Kritik bir adım fare suşu bağlı adapte edilmesi gerekir dispase II tedavi ile dermis epidermis ayrılmasıdır. Dispase II konsantrasyonu 2.5 ile 5 mg / ml, ve 20 ila 45 dakika ile fırınlama süresi aralığında olabilir. Ara filaman protein keratin 14 boyama kolayca bazal epidermal tabaka enfekte veya enfekte olan hücreleri (Şekil 2), sadece çok sınırlı sayıda gösterecektir olmadığını edilip edilem...

Tartışmalar

Yetişkin C57BL / deri 6 epidermal tabakalar HSV-1 ile enfekte olduğunda daha düşük virüs dozları ilişkili ise, yaklaşık olarak 100 PFU / hücre, daha az enfekte olmuş hücrelerin ve daha yavaş olan interfolliküler epidermisin bazal katmanın hemen hemen bütün hücrelerin enfeksiyonu gözlemlemek Enfeksiyonun ilerlemesi. Genel olarak, saç köklerinin enfekte hücrelerin değişken sayısını göstermektedir; Gelişmekte olan saç köklerini astar oldukça küçük keratinositler çoğu enfekte ise, yeti?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX	Life Technologies	31966047	needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder	Roche	4942078001	has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution	Sigma	C5914	needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution	Life Technologies	12563-029	needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin	Bio-Rad	142-2832	needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765	needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)	Covance	PRB-155P	used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-11029	used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)	Life Technologies	A-21429	used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml)	Sigma	36670	used to counterstain the nucleus