双工数字PCR方法的同时定量<em&gt;肠球菌。</em&gt;和人的粪便相关HF183标记的水域

摘要

该原稿描述了一种双工数字PCR分析可以用于同时定量肠球菌和HF183遗传标记在娱乐用水一般与人类相关的粪便污染的指标。

摘要

这份手稿描述了肠球菌的同时定量，和人类粪便相关HF183标记的全双工数字PCR检测（EntHF183 DPCR）。该EntHF183复式DPCR（简称EntHF183 DPCR批文）检测使用相同的引物和探针序列作为其公布的个别定量PCR（定量PCR）同行。同样，如之前的qPCR进行同样的水过滤和DNA提取过程之前运行DPCR遵循。然而，双工DPCR法拥有的qPCR实验几个优点。最重要的是，DPCR测定省去了运行的标准曲线，因此，相关的偏差和变异性，由它的目标直接定量。此外，虽然双工中的qPCR（ 即同时定量） 肠球菌和HF183往往导致的样品中的低丰度目标的严重低估，DPCR同时提供目标的一致定量，磨她在同一反应单独或同时定量。该DPCR测定也能容忍的PCR抑制剂浓度是幅度比那些通过qPCR耐受更高的一到两个数量级。这些优势使得EntHF183 DPCR测定特别有吸引力的，因为它同时提供了在环境水一般和人力相关粪便污染准确和可重复的信息，而不需要运行两个独立的qPCR测定。尽管它的优点在定量PCR中，DPCR测定与现有仪器的上定量限是约幅度比可实现的通过qPCR下部的四个数量。因此，需要一种用于高浓度的靶标生物体，如那些以下污水外溢通常观察到的测量稀释。

引言

定量PCR（qPCR的）的方法已被广泛地用于娱乐水质监测和微生物源跟踪应用，因为它们是更快速，更灵活，相对于传统的基于培养的方法的具体。因此，定量PCR被推荐用于实现一般粪便指标如肠球菌快速水质监测结果。在修订后的USEPA娱乐用水质量标准^1。许多qPCR实验也已开发并验证用于识别环境水²粪便污染的来源。这其中，HF183标记测定法是最常用的用于识别人的相关粪便污染^3。

然而，定量PCR的结果常常可以因为它们依赖于用于定量的标准曲线偏置。通过定量PCR从斯坦的插补周期量化（CQ）量化样品中未知浓度的目标描述Cq的和一组系列稀释的标准的数量之间的线性关系准曲线。因此缺乏可靠和一致的标准参考材料可以大大地偏置的qPCR结果。研究表明的qPCR结果由来自不同供应商⁴大约一半日志使用标准不同，并通过使用标准的不同批次来自相同卖方⁵ 2倍。

数字PCR（DPCR）技术，通过量化大量微型PCR的由分割批量定量PCR成均匀的纳升或皮升的反应⁶十万或上百万计数产生积极的频率未知样品。如果分区是水包油滴（ 即 ，本文），或在一个芯片上的小室被称作液滴数字PCR（ 即 ，这种物品）或室数字PCR，分别。较高的样品浓度将导致靶DNA存在（因此阳性PCR）分区中的比例较高，通过泊松分布近似的关系。因此，二进制的结果（阳性或阴性的PCR）被记录并且正面的液滴的频率用于通过泊松近似值直接计算未知样品浓度，从而消除了如在定量PCR的标准曲线的需要。

这个二进制数字PCR定量性质的qPCR超过⁷提供了更多的优势。因为延迟放大仍然可以产生阳性PCR，定量DPCR反对抑制降低扩增效率更加强劲。同样，DPCR量化不Cq的值是定量PCR，导致DPCR的更高的精度相比的qPCR ^8-10受变性。

此外，该分割过程确保靶DNA存在的极少量在每个液滴，有效地减少基板竞争（amplificatio期间不同的DNA靶）是在定量PCR实现双面打印（ 即化验同时测量两个DNA目标）常见的障碍ñ。正因为如此，无论是在双工或单工运行（ 即一个目标是在一个单一的测定法测量）DPCR产生两种靶^7,11近区分定量。

本文中所描述的数字PCR测定（EntHF183 DPCR）的目标是获得一般粪便指示器肠球菌的同时直接定量。和具有改善的精度，重现性和对抑制鲁棒性人类粪便相关HF183标记相比，其定量PCR同行。该测定中已被成功地用于在环境淡水，海水，以及各种排泄物⁷定量粪便污染，但也可以应用于任何其它类型的水和废水。此法适用于分析沉积物或土壤中，由于它巨大潜力秒超耐受性抑制，但进一步的测试，因为复杂性所需抑制剂在这些类型的样品混合。

研究方案

1.检测混合物准备

1. 请为100μmol/ L浓度的股票在分子级的水全部引物和探针在TE pH值为8的缓冲[肠F1A，肠R1，GPL813TQ ^12; HF183-1，BthetR1，BthetP1 ^3]。
   注:探头的两个目标是荧光标记用不同的荧光⁷作为材料/设备清单表示。
2. 通过混合计划准备主结构，每反应，12微升数字PCR混合物（2倍的股票，见材料/设备清单）每前进，0.216微升和反向引物，0.06微升每个荧光探针和5.016微升无核酸酶的水（终浓度:900纳米每个底漆，250纳米每个探头）。吸管上下的至少10倍，同时服用小心不要在溶液中引入气泡来混合。
3. 吸取18μl反应混合液（步骤1.2）成常规PCR管或板，在6微升DNA模板混合（提取描述页上一页诡^13），使液滴产生测定混合物。如果运行样品一式两份，吸管预混的36微升至12微升DNA模板到每口井。离开相应的重复井上盘空。包括阳性对照（见材料/设备的列表）和无模板对照（NTC）（ 即作为模板分子级水）。
   注:正控制是必要的，以确保该测定正常运行和NTC必须确保有在板内没有污染，并在数据分析以后设置荧光灯基线。第一次建议用户同时使用未稀释和稀释的DNA样本。

2.滴生成和PCR板设置

1. 通过使用多管移液器吹打同比下降约15倍混合测定混合物。确保枪头内保持液态，以避免在混合物中做过多的泡沫。
2. 插件ERT盒1（含8个孔）到白色盒保持器，并点击盒保持器关闭。墨盒1现在是牢固就位，并且不能从持有人在产生飞沫脱落。使用多通道移液管，轻轻转移20微升测定混合物的进入暗盒标记为"样品"的中间位置，而不引入气泡。
3. 吸管70微升液滴生成油到盒的左侧（标记为"油"）。
4. 盖盒带垫片确保垫圈是平坦的，由4均匀地保持蜱朝盒的边缘。按下液滴生成绿色照明按钮，打开并放置盒。再次按下绿色照明按钮，关闭发电机。
   注意:一旦门关闭，按钮是灰色的，门不能被重新打开和液滴产生立即开始约1分钟，继续。
5. 如果在第二个做超过8反应，地方盒2白盒保持器和以相同的方式作为盒1制备而产生液滴正在进行节省总建立时间。
6. 打开液滴生成门口的时候朦胧亮按钮变成绿色表明液滴形成的完成。取出墨盒含1白盒支架，预留和地点盒2到液滴发生器。
7. 从盒中取出1垫圈并丢弃。轻轻地从盒（标记为"小滴"）的第三列到最终的PCR板（保持在室温）下的热循环传送的总体积（大约40微升）中产生的液滴。
   注意:不要取消勾选白盒支架的动作可能打破新产生的飞沫​​;只有后液滴已转移到最终的板打开盒保持器。
8. 重复步骤2.1-2.7额外的样品。
9. 当所有的液滴都在最后的PCR板，放置一个可刺穿在板的顶部电化铝盖，并将其放置在板盖。坐落在封口机封口机到180°C，按"播放"，让密封，持续10秒。

3.热循环和液滴阅读

1. 放置密封板在热循环仪，一用在步骤2.7中使用的最终的PCR板，和2.0℃/秒的温度变化速度相容。
2. 在98℃（可选在94℃在95℃10分钟，接着30秒的40个循环，在60℃下60秒，接着是10分钟保持:运行热方案如下，在4最终保持或15℃）。
3. 在循环结束后，在各孔中板转移到液滴读者为荧光的自动测量在每个液滴。可替代地，存储在4℃的板对液滴读数之前3天。确保液滴在室温下是有阅读，然后再继续。
   1. 打开附带的软件设置液滴读数。在含一个空的96孔板的示意图默认"设置"菜单，双击以及A1打开包含三个部分菜单:"样品"，"试验1"和"2测定"
   2. 在"示例"部分输入样品编号为标有"名"，然后按回车或检查框标记右边的方框"应用"。接下来，单击下拉菜单中标​​记为"实验"，并选择"红色"（罕见的事件检测），并单击进入。
   3. 移动到表示"分析1."一节在"名称"部分填写的检测（ 如 肠球菌 ），然后单击进入。在下面标有"类型"框单击下拉菜单并选择"通道1未知"，然后单击进入。
   4. 移动到表示"检测2."一节在"名称"部分填写的检测（ 如 HF183），然后单击进入。在下面标有"类型"框单击下拉菜单中d选择'频道2未知"，然后单击进入。所有的步骤的信息3.3.2 3.3.4现在出现在A1孔。
   5. 名称含有水滴所有后续井。为了节省安装时间总共，点击"转移"或"Ctrl键"，可以同时选择多个井。
   6. 当板的数字描述反映了物理盘，按"OK"在菜单的右下角。在出现在板原理图顶部的新菜单，在"模板"部分中选择"另存为"，并将其命名并保存板。
   7. 在屏幕的左侧，单击"运行"，然后在弹出的"运行选项"窗口中选择合适的染料组。数据收集起始并在软件中实时显示。

4.数据分析和报告

1. 当阅读器完成，一个箱子出现，说明"运行完成"，然后单击"确定"。
   注:软洁具显示在该软件的"分析"部分中的最后一个数据文件。这种观点认为，该软件对所有的板块中选择的井中，默认为"2D振幅"数据图。
2. 检查正和负的液滴之间的距离。确保在NTC井的所有液滴的荧光接近基线。
3. 单击按钮标记为"事件"。所呈现的直方图右侧单击名为"总计"栏框和底部名为"单"，显示接受液滴总数每口井的框。排除包含<万滴⁷按住Ctrl键并单击井（S），以排除任何井。
4. 点击表示为"1D振幅'在为两种靶的NTC井负液滴上方约一个标准差（500-700荧光单位）来设置荧光阈的按钮。在最左侧的屏幕联合国明镜"自动分析"显示两个门槛按钮，选择图标，有通过它运行了坚实的粉红色水平线的权利。
5. 点击下每个幅度图的框"设置门槛"的左侧，并输入相应的荧光阈值。每微升反应复制的目标浓度，然后自动计算。
   注意:阈值不需要是对于不同的目标是相同的。
6. 通过点击1D幅画面的左上角的"导出"按钮，导出.csv文件的结果。在.csv文件，乘以4的出口目标浓度从每微升反应目标复印件（23S基因肠球菌，或者HF183标记）转换的目标，每微升DNA模板进行复制。

结果

一个好的EntHF183双工DPCR运行应导致相对高一些接受滴（ 约 10,000-17,000）和荧光值相差比较大（ 约 5000）的消极和积极的液滴^7。液滴的不寻常的低数目可能表示在上述液滴生成过程中的问题，和10,000液滴的截止是基于本文中所使用的液滴DPCR系统的经验数据表明。正面和负面的液滴之间疲软的分离（ 即小荧光差异）可能表明抑制或降低探头^7?...

讨论

有在协议中的几个关键步骤。首先，由于主结构比传统的qPCR预混液较粘稠的分​​析混合物混合是很困难的。简单涡旋可能导致混合不充分，从而导致对模板DNA的非均匀分布在测定混合物和随后的液滴。在协议中所描述的混合逐移液技术必须遵循以确保准确的DPCR定量。其次，重要的是要确保液滴在一个均匀的形状和大小产生。谨记场合时的液滴发生器花费来完成液滴上产生一个墨盒是比通常短?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.