Un Test PCR duplex digitale per simultanea quantificazione del<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; E l&#39;umano fecale associata HF183 Marker in Waters

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un saggio PCR duplex digitale che può essere utilizzato per quantificare contemporaneamente Enterococcus spp. E marcatori genetici HF183 come indicatori di contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ricreative.

Abstract

Questo manoscritto descrive una PCR digitale duplex (EntHF183 dPCR) per la quantificazione simultanea di Enterococcus spp. E il marcatore HF183 fecale-associata umana. Il EntHF183 duplex dPCR (denominato come EntHF183 dPCR esso contenute) saggio utilizza gli stessi primer e sonda sequenze come le sue singole controparti pubblicati PCR quantitativa (qPCR). Allo stesso modo, le stesse procedure di filtrazione dell'acqua e di estrazione del DNA come eseguita prima di qPCR sono seguiti prima di eseguire dPCR. Tuttavia, il test dPCR duplex ha diversi vantaggi rispetto ai saggi qPCR. Più importante, il dosaggio dPCR elimina la necessità per l'esecuzione di una curva standard e, quindi, la distorsione e variabilità associata, dalla quantificazione diretta dei suoi obiettivi. Inoltre, mentre la stampa duplex (ovvero la quantificazione simultanea) Enterococcus e HF183 in qPCR spesso porta a grave sottovalutazione del target meno abbondanti in un campione, dPCR fornisce la quantificazione coerente di entrambi gli obiettivi, stuzzicarela quantificato singolarmente o contemporaneamente nella stessa reazione. Il dosaggio dPCR è anche in grado di tollerare concentrazioni di inibitori di PCR che sono uno o due ordini di grandezza superiori a quelle tollerate dal qPCR. Questi vantaggi rendono il saggio EntHF183 dPCR particolarmente interessante perché fornisce contemporaneamente informazioni precise e ripetibili sia contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ambientali senza la necessità di eseguire due saggi qPCR separati. Nonostante i suoi vantaggi rispetto qPCR, il limite superiore quantificazione del test dPCR con strumentazione attualmente disponibile è di circa quattro ordini di grandezza inferiore a quella ottenibile con qPCR. Di conseguenza, la diluizione è necessaria per la misura di concentrazioni elevate di organismi bersaglio come quelli tipicamente osservati dopo fuoriuscite di liquami.

Introduzione

Metodi quantitativi PCR (qPCR) sono stati ampiamente utilizzati per il monitoraggio della qualità delle acque di ricreazione e microbiche applicazioni di tracciamento fonte perché sono più veloci, più flessibili e specifiche rispetto ai metodi di coltura a base di tradizionali. Di conseguenza, qPCR è consigliato per il raggiungimento di risultati di monitoraggio delle acque rapidi per gli indicatori fecali generali come Enterococcus spp. Nelle riviste USEPA ACQUATICI criteri di qualità ^1. Molti saggi qPCR sono stati sviluppati e validati per identificare le fonti di contaminazione fecale nelle acque ambientali ^2. Tra questi, i saggi marcatori HF183 sono tra le più frequentemente utilizzate per identificare la contaminazione fecale umana associata ^3.

Tuttavia, i risultati qPCR possono spesso essere prevenuto perché si basano su curve standard per la quantificazione. qPCR quantifica le concentrazioni sconosciute di bersaglio nei campioni interpolando il loro ciclo di quantificazione (CQ) da una stanCurva dard che descrive una relazione lineare tra Cq e quantità logaritmica di una serie di norme in serie diluiti. La mancanza di materiale di riferimento standard affidabile e coerente può quindi notevolmente BiAS risultati qPCR. Gli studi hanno dimostrato che i risultati qPCR differivano di circa mezzo di registro utilizzando standard di diversi fornitori ^{di 4} e 2 volte con diversi lotti di standard dello stesso fornitore ^5.

La tecnologia digitale PCR (dPCR) quantifica un campione sconosciuto contando la frequenza di positivi in un gran numero di PCR in miniatura che vengono generati dal partizionamento di un qPCR massa in migliaia o milioni di nanolitro uniforme o reazioni picolitri ^6. E 'indicato come gocciolina PCR digitali (cioè, questo articolo) o camera PCR digitali, rispettivamente se le partizioni sono acqua-in-olio gocce (ovvero questo articolo) o piccole camere su un chip. Una concentrazione più elevata del campione comporterà presenza di DNA bersaglio(PCR quindi positivo) in una proporzione maggiore di partizioni, una relazione approssimata dalla distribuzione di Poisson. Come tali, i risultati binari (PCR positiva o negativa) sono registrate e la frequenza delle goccioline positivi viene utilizzato per calcolare le concentrazioni dei campioni sconosciuti direttamente tramite Poisson approssimazione, eliminando la necessità di una curva standard come in qPCR.

Questa natura binaria di quantificazione PCR digitale offre vantaggi supplementari rispetto qPCR ^7. Poiché l'amplificazione ritardato può ancora produrre un PCR positivo, dPCR quantificazione è più robusto contro l'inibizione che riduce l'efficienza di amplificazione. Analogamente, dPCR quantificazione non è influenzato dalla variabilità dei valori Cq come qPCR, portando ad una maggiore precisione di dPCR rispetto al qPCR ^8-10.

Inoltre, il processo di partizionamento assicura una piccola quantità di DNA bersaglio presente in ogni gocciolina, minimizzando efficace concorrenza substrato (durante amplification di differenti target di DNA) che sono ostacoli comuni al raggiungimento fronte-retro (cioè un saggio misura contemporaneamente due obiettivi di DNA) in qPCR. Come tale, eseguita in duplex o simplex (cioè un target viene misurato in un singolo test) dPCR produce quantificazione quasi indistinguibile di entrambi gli obiettivi ^7,11.

L'obiettivo del test PCR digitale (EntHF183 dPCR) descritto in questo articolo è quello di ottenere una quantificazione diretta simultanea dell'indicatore fecale generale Enterococcus spp. E il marcatore HF183 umano-fecale associata con una migliore precisione, la riproducibilità e la robustezza contro l'inibizione rispetto al suo qPCR controparti. Questo test è stato utilizzato con successo per quantificare la contaminazione fecale in acqua dolce ambientale, acqua marina, e vario materiale fecale ^7, ma può anche essere applicato a qualsiasi altro tipo di acque e acque di scarico. Questo test rappresenta una grande promessa per l'analisi di sedimenti o suoli a causa di essas elevata tolleranza alla inibizione, ma ulteriori test è necessario a causa della complessità di inibitore mescola in questi tipi di campioni.

Protocollo

1. test di mescole

1. Fare le concentrazioni di 100 micromol / L stock per tutti i primer in acqua grado molecolare e sonde a TE pH 8 tampone [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Nota: Sonde per i due obiettivi sono fluorescente con diversi fluorofori ⁷ come indicato nella lista dei materiali / attrezzature.
2. Preparare master mix mescolando, per reazione prevista, 12 ml digitale mix PCR (2x magazzino, vedere elenco dei materiali / attrezzature), 0.216 ml ciascuno in avanti e di fondo, 0,06 ml ciascuna sonda fluorescente inversa, e 5.016 ml di acqua priva di nucleasi (concentrazione finale : 900 nM ogni primer, 250 nm ogni sonda). Pipettare su e giù almeno 10 volte per mescolare tenendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione.
3. Pipettare 18 ml Master Mix (dal punto 1.2) in un normale tubo di PCR o piatto, mescolando in DNA stampo 6 ml (estratto come descritto Precesly ¹³⁾ per rendere la miscela test per la generazione di goccioline. Se si esegue i campioni in duplicato, pipetta 36 ml di master mix e 12 stampo di DNA microlitri in tutti i pozzetti. Lasciare le corrispondenti pozzi replicati vuoto sul piatto. Includere controlli positivi (vedi elenco dei materiali / attrezzature) ei controlli NTC (NTC) (cioè con acqua di grado molecolare utilizzato come modello).
   Nota: Controllo positivo è necessario assicurare il test viene eseguito correttamente e il NTC è necessaria per garantire che non vi è alcuna contaminazione all'interno della piastra e per impostare la linea di base fluorescente successiva analisi dei dati. Prima dell'uso si consiglia di utilizzare entrambi i campioni di DNA non diluiti e diluito.

2. Generation Droplet e configurazione Piastra PCR

1. Mescolare le miscele di analisi pipettando su verso il basso di circa 15 volte con una pipetta multicanale. Assicurarsi che la punta della pipetta rimane all'interno del liquido per evitare di fare le bolle in eccesso all'interno della miscela.
2. inscartuccia ert 1 (contenente 8 pozzetti) in un contenitore della cartuccia bianca e fare clic sul supporto della cartuccia chiusa. Cartuccia 1 è ora saldamente in posizione e non può essere staccato dal suo supporto durante la generazione di goccioline. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire delicatamente 20 l di miscela test in posizione centrale della cartuccia indicata 'campione' senza introdurre bolle d'aria.
3. Pipettare in 70 ml di olio di generazione gocciolina al lato sinistro della cartuccia (contrassegnati 'olio').
4. Cartuccia copertura con una guarnizione assicurandosi che la guarnizione sia piana e tenuto in modo uniforme dal 4 zecche verso il bordo della cartuccia. Premere il tasto verde illuminato sul generatore droplet per aprire e inserire la cartuccia. Premere il tasto verde-illuminato di nuovo per chiudere il generatore.
   Nota: Una volta che la porta si chiude, il pulsante non è attivo, la porta non può essere riaperta e la generazione di goccioline inizia immediatamente proseguendo per circa 1 minuto.
5. Se facendo più di 8 reazioni, posto cartuccia 2 in una secondaportacartuccia bianco e preparare nella stessa maniera come cartuccia 1 mentre la generazione delle goccioline è in corso di risparmiare del tempo di programmazione.
6. Aprire la porta generatore gocciolina quando il pulsante dim illuminato diventa verde che indica il completamento della generazione di goccioline. Rimuovere il supporto bianco cartuccia contenente la cartuccia 1, messo da parte, e la cartuccia posto 2 sul generatore di goccia.
7. Rimuovere la guarnizione dalla cartuccia 1 e scartare. trasferire delicatamente il volume totale (circa 40 ml) di goccioline generate dalla terza colonna della cartuccia (contrassegnata 'Goccioline') su una piastra PCR finale (mantenuta a temperatura ambiente) per cicli termici.
   Nota: Non deselezionare il supporto della cartuccia bianca come l'azione potrebbe rompersi le goccioline appena generato; aperto solo il supporto della cartuccia dopo le goccioline sono stati trasferiti al piatto finale.
8. Ripetere i passaggi 2,1-2,7 per i campioni supplementari.
9. Quando tutte le goccioline sono nella piastra finale PCR, posizionare un perforabilepellicola di copertura sulla parte superiore della piastra e posizionarlo su un foglio sigillante. Impostare il sigillante a 180 ° C, premere 'Play' sul sigillante e lasciare tenuta per 10 sec.

3. ciclismo termica e Reading Droplet

1. Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore, uno compatibile con la piastra PCR finale utilizzato nella fase 2.7, e una velocità di rampa di temperatura di 2,0 ° C / sec.
2. Eseguire programma termica come segue: 10 min a 95 ° C, seguiti da 40 cicli di 30 secondi a 94 ° C e 60 secondi a 60 ° C, seguito da 10 min stretta a 98 ° C (opzionale: stretta finale a 4 o 15 ° C).
3. Al termine del ciclismo, trasferire la piastra ad un lettore di goccioline per la misurazione automatica della fluorescenza in ciascuna goccia in ciascun pozzetto. In alternativa, conservare la piastra a 4 ° C per un massimo di 3 giorni prima della lettura delle gocce. Assicurarsi che le goccioline siano a temperatura ambiente prima di procedere con la lettura.
   1. Aprire il software che accompagna per impostare la lettura delle gocce. Inil menu di default 'Setup' contiene uno schema di una piastra da 96 pozzetti vuoto, fare doppio clic sul pozzetto A1 per aprire il menu che contiene tre sezioni: 'Campione,' 'Saggio 1' e 'Assay 2.'
   2. Nella sezione 'Sample' digitare l'ID campione nella casella 'Nome' e premere Invio o controllare la casella a destra segnato 'Apply'. Quindi, fai clic sul menu a discesa con l'etichetta 'esperimento' e scegliere 'Red' (rilevamento di un evento raro) e premere Invio.
   3. Spostare alla sezione indicata 'test 1.' Nella sezione 'Nome' compilare il test (ad esempio Enterococcus) e premere Invio. Nella casella sotto l'etichetta 'Tipo' fai clic sul menu a tendina e selezionare l 'Channel 1 Unknown' e premere Invio.
   4. Spostare alla sezione indicata 'Assay 2.' Nella sezione 'Nome' compilare il test (ad esempio, HF183) e premere Invio. Nella casella sotto l'etichetta 'Tipo' fai clic sul menu a discesa unad Scegliere 'Channel 2 Unknown' e premere Invio. Tutte le informazioni da Piazza 3.3.2 a 3.3.4 è ora presente in ben A1.
   5. Nome tutti i pozzetti successivi contenenti goccioline. Per risparmiare tempo di installazione totale, fare clic su 'Shift' o 'Ctrl', di scegliere pozzi multipli contemporaneamente.
   6. Quando la rappresentazione digitale della piastra rispecchia la piastra fisica, premere 'OK' in basso a destra del menu. Nel nuovo menu che appare nella parte superiore dello schema piatto, sotto la sezione 'Modello' scegliere 'Salva con nome' e il nome e salvare la piastra.
   7. A sinistra dello schermo, fare clic su 'Esegui' e selezionare appropriate Dye Set nella finestra pop-out "Opzioni di esecuzione". La raccolta dei dati inizia e viene visualizzata in tempo reale nel software.

4. Analisi dei dati e reporting

1. Quando il lettore è finito e un dialogo che affermando 'corsa completa', cliccare su 'OK'.
   Nota: La morbidaware visualizza il file di dati finale nella sezione 'Analisi' del software. In questa prospettiva, il software ha tutti i pozzetti della piastra selezionati e le impostazioni predefinite per tracciare i dati del '2D Amplitude'.
2. Controllare la separazione tra le goccioline positivi e negativi. Assicurarsi che la fluorescenza in tutte le goccioline nei pozzetti NTC sono vicino al basale.
3. Fare clic sul pulsante 'Eventi'. A destra dell'istogramma presentato clic sulla casella denominata 'Total' e la casella denominata "single" in basso per visualizzare il numero totale di gocce accettati per pozzetto. Escludere i pozzetti contenenti <10.000 goccioline ⁷ tenendo premuto il tasto Ctrl e facendo clic sul bene (s) da escludere.
4. Fare clic sul pulsante indicato come '1D Amplitude' per impostare la soglia di fluorescenza a circa una deviazione standard (500-700 unità di fluorescenza) sopra le goccioline negativi nei pozzi NTC per entrambi gli obiettivi. Al molto a sinistra dello schermo unof the 'Auto Analyze' che mostra due pulsanti di soglia, scegliere l'icona a destra che ha una linea orizzontale di colore rosa solido che l'attraversa.
5. Fare clic nella casella a sinistra di 'soglia impostata' sotto ciascuno dei grafici di ampiezza e di inserire i valori di soglia di fluorescenza appropriati. Le concentrazioni target di copia per reazione microlitri vengono calcolati automaticamente.
   Nota: Le soglie non devono essere identiche per i diversi target.
6. Esportare i risultati in un file .csv facendo clic sul pulsante 'Export' nell'angolo in alto a sinistra dello schermo 1D ampiezza. Nel file .csv, moltiplicare la concentrazione target esportati da 4 per la conversione da copia del bersaglio (23S gene di Enterococcus spp. O il marcatore HF183) per reazione microlitri per copiare del target per microlitri DNA stampo.

Risultati

Una buona corsa EntHF183 duplex dPCR dovrebbe risultare in numero relativamente elevato di goccioline accettati (circa 10,000-17,000) e differenza relativamente grande (circa 5.000) tra i valori di fluorescenza per le goccioline negativi e positivi ^7. Insolitamente basso numero di goccioline probabilmente indica problemi nel processo di generazione delle gocce, e un taglio di 10.000 goccioline è suggerito basato su dati empirici dal sistema dPCR gocciolina u...

Discussione

Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, la miscelazione delle miscele test può essere difficile, perché il master mix è più viscoso rispetto ai tradizionali Master Mix qPCR. Semplice vortex può portare a scarsa miscelazione, che a sua volta porta alla distribuzione non uniforme dei modelli di DNA nelle miscele di saggio e successivamente nelle goccioline. La tecnica di miscelazione-by-pipettaggio descritto nel protocollo deve essere seguita per garantire accurata quantificazione dPCR. In sec...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.