Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Et le HF183 marqueur humain Fecal associé dans les eaux

Résumé

Ce manuscrit décrit un essai PCR duplex numérique qui peut être utilisé pour quantifier simultanément Enterococcus spp. , Et les marqueurs génétiques HF183 comme indicateurs de contamination fécale générale et humaine associée dans les eaux récréatives.

Résumé

Ce manuscrit décrit un test de PCR numérique duplex (EntHF183 RCPH) pour la quantification simultanée de Enterococcus spp. Et le marqueur humain HF183 fécale associée. Le EntHF183 duplex RCPH (dénommé EntHF183 RCPH de maintenant) test utilise les mêmes amorces et sondes séquences que ses PCR quantitative (qPCR) homologues individuels publiés. De même, les mêmes procédures de filtration d'eau et d'extraction d'ADN effectuée avant qPCR sont suivies avant d'exécuter RCPH. Cependant, le dosage duplex DPCR présente plusieurs avantages par rapport aux essais de qPCR. Plus important encore, le dosage RCPH élimine la nécessité d'exécuter une courbe standard et donc, le biais et la variabilité associée, par quantification directe de ses objectifs. En outre, alors que duplexage (c. -à- quantification simultanée) Enterococcus et HF183 en qPCR conduit souvent à une sous - estimation grave de la cible moins abondante dans un échantillon, RCPH fournit une quantification cohérente des deux cibles, aiguisentelle quantifié individuellement ou simultanément dans la même réaction. Le dosage DPCR est également capable de tolérer des concentrations d'inhibiteur de PCR qui sont un à deux ordres de grandeur plus élevées que celles tolérées par qPCR. Ces avantages font l'essai EntHF183 RCPH particulièrement intéressante, car elle fournit simultanément des informations précises et reproductibles à la fois sur la contamination générale et humaine associée fécale dans les eaux environnementales sans la nécessité d'exécuter deux essais qPCR séparés. En dépit de ses avantages sur qPCR, la limite de quantification supérieure du dosage RCPH avec instrumentation disponible actuellement est d'environ quatre ordres de grandeur inférieure à celle obtenue par qPCR. Par conséquent, la dilution est nécessaire pour la mesure des concentrations élevées d'organismes cibles, tels que ceux qui sont habituellement observés à la suite de déversements d'eaux usées.

Introduction

Les méthodes quantitatives PCR (qPCR) ont été largement utilisés à des fins récréatives surveillance de la qualité de l'eau et microbiennes des applications de suivi de la source, car ils sont plus rapides, plus flexibles et spécifiques par rapport aux méthodes basées sur la culture traditionnelle. Par conséquent, qPCR est recommandé pour obtenir des résultats de surveillance des eaux rapides des indicateurs fécaux généraux tels que Enterococcus spp. , Dans la version révisée de l' EPA eau récréative des critères de qualité ^1. De nombreux essais qPCR ont également été mis au point et validé pour identifier les sources de contamination fécale dans les eaux environnementales ^2. Parmi ceux - ci, le dosage des marqueurs HF183 sont parmi les plus fréquemment utilisés pour identifier la contamination fécale ³ humaine associée.

Cependant, les résultats de qPCR peuvent souvent être biaisés car elles reposent sur des courbes standards pour la quantification. qPCR quantifie concentrations inconnues de cible dans les échantillons par interpolation de leur cycle de quantification (Cq) à partir d'un stancourbe de norme qui décrit une relation linéaire entre Cq et la quantité logarithmique d'un ensemble de normes en série dilué. Le manque de matériel de référence standard fiable et cohérente peut donc fausser considérablement les résultats de qPCR. Des études ont montré que les résultats de qPCR différaient d'environ un demi - log en utilisant des normes de différents fournisseurs et ⁴ par 2 fois en utilisant différents lots de normes du même fournisseur ^5.

PCR (RCPH) La technologie numérique quantifie un échantillon inconnu en comptant la fréquence des points positifs dans un grand nombre de RFP miniatures qui sont générés par le partitionnement d' un qPCR en vrac dans des milliers ou des millions de nanolitre uniforme ou réactions picolitres ^6. Il est mentionné que gouttelette PCR numérique (c. -à cet article) ou une chambre PCR numérique, respectivement, si les partitions sont des gouttelettes d' eau dans l'huile ( par exemple, cet article) ou de petites chambres sur une puce. Une concentration plus élevée de l'échantillon se traduira par la présence de l'ADN cible(PCR donc positif) dans une proportion plus élevée de partitions, une relation approchée par la loi de Poisson. En tant que tel, les résultats binaires (PCR positive ou négative) sont enregistrées et la fréquence de gouttelettes positives sont utilisées pour calculer les concentrations d'échantillons inconnus directement par approximation de Poisson, ce qui élimine la nécessité d'une courbe standard comme dans qPCR.

Cette nature binaire de quantification par PCR numérique offre des avantages supplémentaires sur qPCR ^7. Parce que l'amplification retardé peut encore obtenir une PCR positive RCPH quantification est plus robuste contre l'inhibition qui réduit l'efficacité de l'amplification. De même, RCPH quantification ne soit pas affectée par la variabilité des valeurs Cq comme est qPCR, conduisant à une plus grande précision de RCPH par rapport à qPCR ^8-10.

En outre, le procédé de séparation assure une très petite quantité d'ADN cible présente dans chaque goutte, ce qui réduit efficacement la concurrence du substrat (pendant amplification des différentes cibles d'ADN) qui sont des obstacles communs à la réalisation de duplexage (ie un test mesure simultanément deux cibles d'ADN) dans qPCR. En tant que tel, si l' exécution en duplex ou simplex (ie une cible est mesurée en un seul essai) RCPH produit quantification presque indiscernables des deux cibles ^7,11.

Le but du test de PCR numérique (EntHF183 RCPH) décrit dans cet article est d'obtenir une quantification directe simultanée de l'indicateur fécal général Enterococcus spp. Et le marqueur HF183 humain-fécale associée à une précision améliorée, la reproductibilité et la robustesse contre l' inhibition par rapport à son qPCR homologues. Ce test a été utilisé avec succès pour quantifier la contamination fécale dans l' eau douce de l' environnement, l' eau de mer, et diverses matières fécales ^7, mais peut également être appliquée à d'autres types d'eaux et des eaux usées. Ce test est très prometteur pour l'analyse de sédiments ou des sols en raison de sons grande tolérance à l'inhibition, mais des tests supplémentaires sont nécessaires en raison de la complexité du mélange inhibiteur dans ces types d'échantillons.

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Protocole

1. Assay Mélange Préparation

1. Faire des concentrations 100 pmol / L de stock pour toutes les amorces dans l' eau moléculaire de qualité et des sondes de pH 8 tampon TE [Entéro F1A, Entéro R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Note: Les sondes pour les deux cibles sont marquées par fluorescence avec différents fluorophores ⁷ , comme indiqué dans la liste des matériaux / équipement.
2. Préparer mélange maître en mélangeant, par réaction prévu, 12 ul mélange PCR numérique (2x stocks, voir Liste des Matériaux / Équipement), 0,216 ul chacun avant et amorce, 0,06 ul de chaque sonde fluorescente inverse, et 5.016 pi d'eau sans nucléase (concentration finale : 900 nM de chaque amorce, 250 nM chaque sonde). Pipeter haut et en bas au moins 10 fois pour mélanger tout en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air dans la solution.
3. Pipette master mix de 18 pi (de l'étape 1.2) dans un tube PCR régulier ou d'une plaque, le mélange dans 6 pi de matrice d'ADN (extrait comme décrit Previously ¹³⁾ pour faire mélange d'essai pour la génération de gouttelettes. Si vous utilisez des échantillons en double exemplaire, pipette 36 pi de mélange maître et 12 matrice d'ADN ul dans chaque puits. Laissez les puits répliqués correspondant vide sur la plaque. Inclure les contrôles positifs (voir la liste des matériaux / équipement) et aucun contrôle de modèle (NTC) (ie avec l' eau de qualité moléculaire utilisé comme modèle).
   Remarque: Le contrôle positif est nécessaire pour assurer le dosage fonctionne correctement et le CNT est nécessaire pour assurer qu'il n'y a pas de contamination à l'intérieur de la plaque et de fixer la ligne de base fluorescente plus tard dans l'analyse des données. Les nouveaux utilisateurs sont invités à utiliser les deux échantillons d'ADN non dilué et dilué.

2. Génération Droplet et PCR Setup Plate

1. Mélanger les mélanges de dosage par aspiration vers le bas environ 15 fois à l'aide d'une pipette multicanaux. Assurez-vous que la pointe de la pipette reste dans le liquide pour éviter de faire des bulles en excès dans le mélange.
2. Inscartouche de ert 1 (contenant 8 puits) dans un support de cartouche blanc et cliquez sur la fermeture de porte-cartouche. Cartouche 1 est maintenant fermement en place et ne peut pas être délogé du support tout en générant des gouttelettes. À l'aide d'une pipette à canaux multiples, le transfert en douceur 20 ul de mélange de dosage dans la position médiane de la cartouche marquée «échantillon» sans introduire de bulles d'air.
3. Pipeter dans 70 ul d'huile de génération de gouttelettes sur le côté gauche de la cartouche (marquée «Oil»).
4. cartouche de couverture avec un joint en vous assurant que le joint est plat et maintenu uniformément par le 4 ticks vers le bord de la cartouche. Appuyez sur le bouton vert allumé sur le générateur de gouttelettes pour ouvrir et placer la cartouche. Appuyez sur le bouton vert allumé à nouveau pour fermer le générateur.
   Remarque: Une fois que la porte se ferme, le bouton est grisé, la porte ne peut pas être rouvert et la génération de gouttelettes commence immédiatement poursuivre pendant environ 1 min.
5. Si faire plus de 8 réactions, lieu cartouche 2 dans un secondporte-cartouche blanc et préparer de la même manière que la cartouche 1, tandis que la génération des gouttelettes est en cours pour gagner du temps d'installation totale.
6. Ouvrez la porte du générateur de gouttelettes lorsque le bouton dim éclairé devient vert indiquant la fin de la génération de gouttelettes. Retirez le support blanc de la cartouche contenant la cartouche 1, mis de côté, et le lieu cartouche 2 sur le générateur de gouttelettes.
7. Retirez le joint de la cartouche 1 et le jeter. transférer doucement le volume total (environ 40 pi) de gouttelettes générées à partir de la troisième colonne de la cartouche (marquée 'Droplets') sur une plaque PCR finale (maintenue à la température ambiante) pour le cyclage thermique.
   Remarque: Ne décochez le porte-cartouche blanche que l'action peut briser les gouttelettes nouvellement générées; seulement ouvrir le support de la cartouche après que les gouttelettes ont été transférées à la plaque finale.
8. Répétez les étapes 2,1-2,7 pour les échantillons supplémentaires.
9. Lorsque toutes les gouttelettes sont dans la plaque finale PCR, placez un perçablecouverture feuille sur le dessus de la plaque et la placer sur un scellant pour plaques. Réglez le scellant à 180 ° C, appuyez sur 'Play' sur le scellant et laisser joint pendant 10 sec.

3. Cyclisme thermique et Droplet lecture

1. Placer la plaque scellée sur le cycleur thermique, qui soit compatible avec la plaque PCR finale utilisée dans l'étape 2.7, et une vitesse de montée en puissance de la température de 2,0 ° C / sec.
2. Exécutez le programme thermique comme suit: 10 min à 95 ° C, suivie de 40 cycles de 30 s à 94 ° C et 60 sec à 60 ° C, suivie d'une 10 min maintien à 98 ° C (en option: prise finale à 4 ou 15 ° C).
3. À la fin du cyclage, transférer la plaque à un lecteur Droplet pour la mesure automatique de la fluorescence dans chaque goutte dans chaque puits. Vous pouvez également stocker la plaque à 4 ° C jusqu'à 3 jours avant gouttelette lecture. Assurez-vous que les gouttelettes sont à la température ambiante avant de procéder à la lecture.
   1. Ouvrez le logiciel d'accompagnement pour configurer la lecture des gouttelettes. Dansle menu par défaut "Setup" contenant un schéma d'une plaque de 96 puits vide, double cliquez sur le puits A1 pour ouvrir le menu contenant trois sections: 'exemples,' 'Assay 1' et 'Test 2.'
   2. Dans la section "Sample" tapez l'ID d'échantillon dans la case "Nom" et appuyez sur Entrée ou cocher la case à la droite marquée «Appliquer». Ensuite, cliquez sur le menu déroulant étiqueté «Experiment» et choisissez «RED» (détection d'événements rares) et cliquez sur entrer.
   3. Déplacer vers la section notée 'Essai 1.' Dans la section "Nom" remplir le dosage (par exemple Enterococcus) et cliquez sur entrer. Dans la boîte ci-dessous intitulée "Type" cliquez sur le menu déroulant et choisissez «Canal 1 Unknown" et cliquez sur entrer.
   4. Déplacer vers la section notée 'Assay 2.' Dans la section "Nom" remplir le dosage (par exemple HF183) et cliquez sur entrer. Dans la boîte ci-dessous intitulée «Type» cliquez sur le menu déroulant uned Sélectionnez 'Channel 2 Unknown "et cliquez sur entrer. Toutes les informations à partir étapes 3.3.2 à 3.3.4 est maintenant présent dans le puits A1.
   5. Nom tous les puits suivants contenant des gouttelettes. Pour gagner du temps de configuration totale, cliquez sur "Shift" ou "Ctrl", de choisir plusieurs puits simultanément.
   6. Lorsque la représentation numérique de la plaque reflète la plaque physique, appuyez sur 'OK' en bas à droite du menu. Dans le nouveau menu qui apparaît en haut du schéma de la plaque, sous la section "Modèle" choisissez «Enregistrer sous» et le nom et enregistrer la plaque.
   7. A gauche de l'écran cliquez sur "Exécuter" et sélectionnez Dye Set approprié dans le pop-out fenêtre "Options d'exécution". La collecte des données se déclenche et affichées en temps réel dans le logiciel.

4. Analyse des données et rapports

1. Lorsque le lecteur est terminé et une boîte apparaît indiquant «Run Complete ', cliquez sur' OK '.
   Remarque: Le douxWare affiche le fichier final de données sous la rubrique «Analyse» du logiciel. Dans cette optique, le logiciel a tous les puits de la plaque sélectionnés et par défaut tracé de données le «2D Amplitude».
2. Vérifier la séparation entre les gouttelettes positives et négatives. Assurez-vous que la fluorescence dans toutes les gouttelettes dans les puits NTC sont près de la ligne de base.
3. Cliquez sur le bouton intitulé «Événements». A droite de l'histogramme présenté cliquez sur la case nommée «Total» et la boîte nommée "single" dans le bas pour afficher le nombre total de gouttelettes acceptées par puits. Exclure tous les puits contenant <10.000 gouttelettes ⁷ en maintenant la touche Ctrl et en cliquant sur ​​le bien (s) à exclure.
4. Cliquez sur le bouton désigné comme «1D Amplitude» pour définir le seuil de fluorescence à environ un écart-type (500-700 unités de fluorescence) au-dessus des gouttelettes négatives dans les puits NTC pour les deux cibles. A l'extrême gauche de l'ONU d'écrander 'Analyser Auto' l'montrant deux boutons de seuil, sélectionnez l'icône à la droite qui a une ligne horizontale solide rose qui la traverse.
5. Cliquez dans la case à gauche du 'Seuil Set' sous chacun des graphiques d'amplitude et entrez les valeurs de seuil de fluorescence appropriés. Les concentrations cibles dans la copie par réaction ul sont ensuite calculés automatiquement.
   Remarque: Les seuils ne doivent pas être identiques pour les différentes cibles.
6. Exporter les résultats dans un fichier .csv en cliquant sur le bouton "Exporter" dans le coin supérieur gauche de l'écran 1D Amplitude. Dans le fichier .csv, multiplier la concentration cible exportée par 4 pour le convertir de la copie de la cible (23S gène d'Enterococcus spp. , Ou le marqueur de HF183) par réaction ul pour copier de la cible par ul matrice d'ADN.

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Résultats

Un bon run EntHF183 duplex RCPH devrait se traduire par nombre relativement élevé de gouttelettes reconnues (ca. 10,000-17,000) et différence relativement importante (environ 5000) entre les valeurs de fluorescence pour gouttelettes négatives et positives ^7. Exceptionnellement faible nombre de gouttelettes indique probablement des problèmes dans le processus de génération de gouttelettes, et un seuil de 10.000 gouttelettes est proposé sur la base des ...

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Discussion

Il y a quelques étapes critiques dans le protocole. Tout d'abord, le mélange des mélanges d'essai peut être difficile parce que le mélange maître est plus visqueux que les mélanges maîtres qPCR classiques. tourbillonnement simple peut conduire à un mélange insuffisant, ce qui à son tour conduit à une distribution non uniforme des matrices d'ADN dans les mélanges d'essai, puis dans les gouttelettes. La technique de mélange par pipetage décrit dans le protocole doit être suivi pour assurer ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.