Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

Özet

Bu yazıda, aynı anda Enterococcus spp ölçmek için kullanılabilecek bir çift yönlü dijital PCR deneyi. Ve eğlence sularda genel olarak insan ilişkili dışkı kirlenme göstergeleri olarak HF183 genetik işaretleyiciler açıklanmaktadır.

Özet

Bu yazının Enterococcus spp eşzamanlı ölçümü. Ve insan fekal-ilişkili HF183 işaretleyici için bir dubleks dijital PCR testi (EntHF183 dPCR) açıklar. EntHF183 dubleks dPCR (EntHF183 dPCR olarak anılacaktır buradan sonra) deneyi yayınlanmış bireysel kantitatif PCR (qPCR) meslektaşlarıyla aynı primer ve prob dizileri kullanır. Aynı şekilde, önce qPCR uygulandı aynı su filtreleme ve DNA ekstraksiyon prosedürleri dPCR çalıştırmadan önce takip edilmektedir. Ancak, dubleks dPCR tahlil qPCR deneyleri üzerinde birçok avantajı vardır. En önemlisi, dPCR tahlil hedefleri doğrudan ölçümü ile dolayısıyla standart bir eğri çalışan ve ihtiyacını, ilgili önyargı ve değişkenliği, ortadan kaldırır. QPCR (yani eşzamanlı kantifikasyon) enterokokların ve HF183 arkalı önlü ise ek olarak, çoğu kez bir numunede daha az bol hedefin ciddi küçümsenmesi yol açar, dPCR hem hedeflerin tutarlı ölçümü sağlar, uyandırmakona aynı reaksiyonda eş zamanlı olarak tek başına ya da miktarı. dPCR deneyi de qPCR tolere daha yüksek büyüklükte bir ya da iki emirler PCR inhibitörü konsantrasyonları tolere edebilmektedir. aynı anda iki ayrı qPCR deneyleri çalıştırmak için gerek kalmadan çevre sularda hem genel hem de insan-ilişkili fekal kontaminasyon doğru ve tekrarlanabilir bilgi sağlar, çünkü bu avantajlar EntHF183 dPCR tahlil özellikle çekici olun. qPCR üzerindeki avantajlara rağmen, şu anda mevcut cihaz olan dPCR deneyinde üst miktar sınırı yaklaşık qPCR elde edilebilenden daha düşük bir magnitüd dört işlemlerdir. Sonuç olarak, seyreltme, tipik pis su sızıntıları ardından gözlenen hedef organizmaların yüksek konsantrasyonlarının ölçümü için gereklidir.

Giriş

daha hızlı, daha esnek ve geleneksel kültür temelli yöntemlerle karşılaştırıldığında özel çünkü kantitatif PCR (qPCR) yöntemleri yaygın eğlence su kalitesi izleme ve mikrobiyal kaynak takibi uygulamalarında kullanılmaktadır. Sonuç olarak, qPCR gibi Enterococcus spp gibi genel fekal göstergeler için hızlı su izleme sonuçları elde etmek için tavsiye edilir. Revize USEPA eğlence su kalite kriterleri ^1. Birçok qPCR deneyleri de geliştirilmiş ve çevresel sularda ² fekal kontaminasyon kaynaklarının belirlenmesi için onaylanmıştır. Bunlar arasında, HF183 işaretleyici deneyleri en sık insan ilişkili fekal kontaminasyonu ³ tanımlamak için kullanılan arasındadır.

onlar ölçümü için standart eğriler güveniyor Ancak, qPCR sonuçlar genellikle önyargılı olabilir. qPCR bir stan kendi ölçümü döngüsünü (Cq) enterpolasyonlayarak örneklerinde hedefin bilinmeyen konsantrasyonlarını rakamlarlaCq ve seri seyreltilmiş standartların bir dizi logaritmik miktarı arasında doğrusal bir ilişki açıklanır dart eğrisi. güvenilir ve tutarlı standart referans malzeme eksikliği dolayısıyla büyük ölçüde qPCR sonuçlarını taraflı olabilir. Çalışmalar qPCR sonuçları farklı satıcılardan ⁴ yaklaşık yarım günlük kullanarak standartlarına göre farklılık ve aynı satıcıdan ^5'ten standartların farklı toplu kullanarak 2 kat ile gösterdi.

Dijital PCR (dPCR) teknolojisi üniforma Nanoliter veya pikolitrelik reaksiyonlar ⁶ binlerce ya da milyonlarca içine toplu qPCR bölümleme tarafından oluşturulan minyatür PCR'ler çok sayıda pozitif sıklığını sayarak bilinmeyen bir örnek rakamlarla. Bölmeler-içinde-su yağ damlacıkları (örneğin, bu makale) ya da çip küçük fonksiyonlu odalar olması durumunda bu, sırası ile (yani, bu makale) damlacık dijital PCR veya odası, dijital PCR olarak ifade edilir. Daha yüksek bir Örnek konsantrasyonu hedef DNA'nın mevcudiyetinde sonuçlanırbölümleri daha yüksek bir oranda (dolayısıyla pozitif PCR), Poisson dağılımı ile yaklaştırılır bir ilişki. Bu nedenle, ikili sonuçlar (pozitif ya da negatif PCR) kaydedilir ve pozitif damlacıkların frekansı qPCR olarak standart bir eğri olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, doğrudan Poisson yaklaşım ile bilinmeyen numune konsantrasyonları hesaplamak için kullanılır.

Dijital PCR nicelikleme Bu ikili doğası qPCR ⁷ üzerinde ek avantajlar sağlamaktadır. gecikmiş amplifikasyon hala olumlu bir PCR sağlayabilir, çünkü dPCR miktar amplifikasyon verimliliği azaltır inhibisyonuna karşı daha sağlamdır. QPCR ^8-10 göre dPCR yüksek hassasiyet yol qPCR olarak Benzer şekilde, dPCR miktar Cq değerleri değişkenlik etkilenmez.

Buna ek olarak, bölme işlemi etkin bir şekilde amplificatio sırasında (alt-tabaka rekabet en aza indirerek, her damla hedef DNA mevcut çok az miktarda sağlanırqPCR (yani bir tahlil aynı anda iki DNA hedefleri ölçen) duplekslemeyi ulaşmak için ortak engeller farklı DNA hedefleri) n. Bu nedenle, dubleks veya simpleks çalışma (yani bir hedef, tek bir deneyde ölçülen) olmadığını dPCR her iki hedeflerin ^7,11 neredeyse ayırt edilemez miktarının üretir.

Bu makalede açıklanan dijital PCR deneyi (EntHF183 dPCR) amacı, genel dışkı göstergesi Enterococcus spp Eş zamanlı miktarının elde etmektir. Ve geliştirilmiş hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve inhibisyonuna karşı sağlamlığı olan insan dışkı ilişkili HF183 markör olarak qPCR karşılaştırıldığında uzantılarıdır. Bu deney, başarılı bir şekilde, çevresel tatlı su, deniz suyu ve çeşitli dışkı maddesinin ⁷ dışkı kirlenme ölçülmesi için kullanılmıştır, ama aynı zamanda suları ve atık suların bir diğer türlerine de uygulanabilir. Bu tahlil, kendisine bağlı tortuları veya topraklar analiz etmek için büyük söz sahibidirinhibisyonuna yüksek tolerans s, ancak inhibitör örnekleri, bu tür karışımlar daha fazla test için karmaşıklığı gereklidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Deney karışımı hazırlanması

1. TE pH 8 tamponu tüm moleküler sınıf su içinde primer ve prob [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ¹² 100 mol / L stok konsantrasyonları olun; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Not: iki hedef için sondalar floresan Malzemeleri / Ekipman Listesinde belirtildiği gibi farklı fluorophores ⁷ ile etiketlenir.
2. Planlı reaksiyon başına, karıştırarak 12 ul dijital PCR karışımı master karışımı hazırlayın, 0.216 ul ileriye her (2x stok, Malzeme / Ekipman listesi) ve astar, 0.06 ul her floresan prob ters ve nükleaz içermeyen su ul 5,016 (son konsantrasyon : 900 nM herbir primer, 250 nM her sonda). çözelti içinde hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli çekerken karışımı aşağı en az 10 kere pipet ve.
3. 6 ul DNA şablonunda karıştırma düzenli PCR tüp ya da plaka içine, (adım 1.2 dan itibaren) Pipet 18 ul ana karışımı (tarif Previou olarak çıkarılankurnaz ¹³⁾ damlacık üretimi için tahlil karışım yapmak. nüsha halinde numune çalışıyorsa, pipet ana karışımı 36 ul ve her kuyuya 12 ul DNA şablonu. plaka üzerinde gelen çoğaltmak kuyu boş bırakın. Pozitif kumandaları (Malzeme / Ekipman Listesi) ve hiçbir şablon kumandaları (NTC) ekleyin (yani şablon olarak kullanılan moleküler sınıf su ile).
   Not: Pozitif kontrol deneyi düzgün çalıştığından emin olmak için gereklidir ve NTC plaka içinde herhangi bir kirlenme olmadığından emin olmak için ve veri analizi daha sonra floresan taban ayarlamak gerekir. İlk kez kullananlar hem sulandırılmamış ve seyreltilmiş DNA örnekleri kullanılması tavsiye edilir.

2. Damlacık Nesil ve PCR Plate Kurulumu

1. Çok kanallı pipet kullanarak aşağı yaklaşık 15 kat kadar pipetleme tahlil karışımları karıştırın. pipet ucu karışımı içinde aşırı kabarcıklar yapmaktan kaçınmaya sıvı içinde kalır emin olun.
2. insert beyaz bir kartuş tutucu içine kartuşu 1 (içeren 8 kuyu) ve kartuş tutucu kapalı tıklayın. Kartuş 1 sıkıca yerinde şimdi ve damlacıklar üretirken sahibinden yerinden edilemez. Bir çok kanallı pipet kullanarak, yavaşça hava kabarcıkları tanıtan olmadan kartuş işaretli 'Örnek' orta pozisyona tahlil karışımı 20 ul aktarın.
3. Pipetleyin kartuşunun sol tarafına damlacık oluşturma yağı 70 ul ( 'Petrol' işaretli).
4. Bir conta conta, düz ve 4 ile eşit tutulan emin yapma kapak kartuş kartuşun kenarına doğru keneler. açın ve kartuşu yerleştirmek için damlacık jeneratör yeşil ışıklı düğmesine basın. Basın jeneratör kapatmak için düğmeye tekrar yeşil-lit.
   Not: Kapı kapanır sonra, düğmesi soluk, kapı yeniden açılamaz ve damlacık oluşturma hemen yaklaşık 1 dakika boyunca devam başlar.
5. bir saniye fazla 8 reaksiyonları, yer kartuş 2 yapıyor,damlacık oluşturma toplam kurulum zaman kazanmak için devam ederken, beyaz kartuş tutucu ve kartuş 1 ile aynı şekilde hazırlayın.
6. loş ışıklı buton damlacık nesil tamamlandığını belirten yeşile döndüğünde damlacık jeneratör kapağını açın. damlacık jeneratör üzerine beyaz kartuş 1 içeren kartuş tutucu, kenara, ve yer kartuşunu çıkarın 2.
7. kartuşun 1 contayı çıkarın ve atın. Yavaşça ısıl çevrimden (oda sıcaklığında muhafaza edilen) son bir PCR plaka üzerine kartuş ( 'damlacıklar' işaretli) üçüncü sütunda elde edilen damlacıkların toplam hacmi (yaklaşık 40 ul) aktarın.
   Not: Yeni oluşturulan damlacıkların kırılabilir eylem olarak beyaz kartuşu yuvasını unclick etmeyin; damlacıkları son plakasına aktarıldıktan sonra sadece kartuş yuvasını açın.
8. Tekrarlayın ek örnekler için 2,1-2,7 adımları.
9. Bütün damlacıklar, nihai PCR plaka olduğu zaman, bir delinebilir yerplaka üzerine folyo kapağı ve bir plaka kapatıcı üzerine yerleştirin. mühürleyen 180 ° C, basın 'Play' ile mühürleyen ayarlayın ve 10 saniye boyunca mühür verelim.

3. Termal Bisiklet ve Damlacık Okuma

1. termal döngü sızdırmaz plakasını, aşama 2.7'de kullanılan nihai PCR plaka ve 2.0 ° C / saniyenin altındaki bir ısı rampa hızı ile uyumlu olan bir.
2. şu şekilde ısı programı çalıştırmak: 10 dakika tutuldu, ardından 94 ° C'de 30 saniye 40 döngü, ardından 95 ° C'de 10 dakika ve 60 ° C'de 60 saniye, isteğe 98 ° C'de (en: son tutma 4 ° C'de ya da 15 ° C).
3. bisiklet tamamlanması üzerine, her bir her bir damlacık floresans otomatik olarak belirlenmesi için, bir damlacık Reader plaka aktarın. Seçenek olarak ise, damlacık okuma önce 3 gün süreyle 4 ° C'de plaka saklayın. damlacıklar okuma ile devam etmeden önce oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
   1. kurulum damlacık okuma eşlik yazılımını açın. İçinde'Örnek', 'Deney 1' ve 'Deney 2.': Boş 96 plaka bir şemasını içeren varsayılan 'Ayarlar' menüsü, çift, üç bölümden içeren bir menüyü açmak için de A1 tıklayın
   2. 'Örnek' bölümündeki 'Adı' ve enter tuşuna basın veya işaretli sağa onay kutusunu etiketli kutunun içine örnek kimliğini yazın 'uygulayın.' Sonraki menü etiketli 'Deney' açılır tıklayın ve 'KIRMIZI' (nadir bir olay algılama) seçin ve girin tıklayın.
   3. 'Deney 1.' belirtilen bölüme taşıyın 'Ad' bölümünde tahlili (örneğin Enterococcus) doldurun ve girin tıklayın. etiketli 'Türü' aşağıdaki kutuya açılır menüyü tıklayın ve 'Kanal Bilinmeyen 1' seçin ve girin tıklayın.
   4. 'Deney 2.' belirtilen bölüme taşıyın 'Ad' bölümünde tahlili (örn HF183) doldurun ve girin tıklayın. etiketli 'Türü' aşağıdaki kutuya menü açılır tıklayın'Kanal Bilinmeyen 2' seçin ve girin tıklayın d. 3.3.4 3.3.2 şimdi Adımlar tüm bilgiler A1 kuyusunda sunuyoruz.
   5. damlacıkları içeren sonraki tüm kuyu adı. toplam kurulum Zaman kazanmak için, aynı anda birden fazla kuyu seçmek için 'Shift' veya 'Ctrl' tıklayın.
   6. plaka dijital tasviri menüsünün sağ alt köşesinde fiziksel plaka, 'Tamam'a basın aynalar zaman. 'Şablon' bölümünde plaka şematik üst kısmında görünen yeni menüsünde, 'Farklı Kaydet' ve adını seçin ve plaka kaydedin.
   7. Ekranın solunda 'Çalıştır' ı tıklatın ve pop-out "Run Seçenekleri" penceresinde uygun boya Set seçin. Veri toplama başlatır ve yazılım gerçek zamanlı olarak görüntülenir.

4. Veri Analiz ve Raporlama

1. okuyucu bitti ve bir kutu 'Tam Run' belirterek göründüğünde, 'Tamam' ı tıklatın.
   Not: Yumuşakware yazılım 'Analiz' bölümünün altında son veri dosyasını görüntüler. Bu görüşe göre, yazılım '2B Genlik' veri arsa seçilen tüm plaka kuyular ve varsayılan vardır.
2. Pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki mesafeyi kontrol edin. NTC kuyularda tüm damlacıkları floresan başlangıca yakın olduğundan emin olun.
3. etiketli butonuna tıklayın 'Olaylar.' sunulan histogramın sağındaki 'Toplam' adlı kutu ve başına kabul görmüş damlacıkların toplam sayısını görüntülemek için alt kısımdaki "tek" adlı kutusunu tıklatın. Ctrl tuşunu basılı tutarak ve hariç tutulacak kuyu (ler) üzerine tıklayarak <10.000 damlacıkları ⁷ içeren herhangi bir kuyu hariç.
4. Her iki hedefler için NTC kuyularda olumsuz damlacıklar üzerinde yaklaşık bir standart sapma (500-700 floresan birimleri) floresan eşik ayarlamak için '1D Genlik' olarak ifade butonuna tıklayın. Ekran un çok sol atİki eşik düğmelerini gösteren 'Otomatik Analiz' üzerinden çalışan bir katı pembe yatay çizgi vardır sağdaki simgeyi seçin der.
5. genlik grafikleri her birinin altında 'Set Eşik' Solundaki kutuya tıklayın ve uygun floresan eşik değerleri girin. ul reaksiyon başına kopya hedef konsantrasyonları daha sonra otomatik olarak hesaplanır.
   Not: eşikleri farklı hedefler için aynı olması gerekmez.
6. 1D Genlik ekranın sol üst köşesindeki 'Export' düğmesini tıklayarak bir .csv dosyasına sonuçları ihracat. .csv Dosyası, DNA şablonuna ul başına hedef kopyalamak için ul reaksiyon başına hedefin kopyası (Enterococcus spp 23S geni. Veya HF183 işaretleyici) onu dönüştürmek için 4 tarafından ihraç edilen hedef konsantrasyon çarpın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İyi bir EntHF183 dupleks dPCR çalıştırma kabul damlacıklar (yaklaşık 10,000-17,000) ve negatif ve pozitif damlacıklar ⁷ floresans değerleri arasında nispeten daha büyük bir fark (yaklaşık 5.000) nispeten yüksek sayıda neden olmalıdır. damlaların alışılmadık az sayıda büyük olasılıkla damlacık oluşturma sürecinde sorunları gösterir ve 10.000 damlacıkların bir kesim bu makalede kullanılan damlacık dPCR sisteminden ampirik v...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

protokolde birkaç kritik adımlar vardır. Ana Karışım, geleneksel qPCR ana karışımları daha viskoz olduğundan ilk deney karışımları karıştırılması zor olabilir. Basit vorteksleme da deney karışımları ve daha sonra damlacıklar DNA şablonları eşit olmayan dağılımına neden olur yeterli karıştırma, neden olabilir. protokol açıklanan karıştırma-by-pipetleme tekniği doğru dPCR ölçümünü sağlamak için takip edilmelidir. İkinci olarak, damlacıklar tek yapılı bir şekle ve boyut...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.