の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ<em&gt;エンテロコッカス属。</em&gt;およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー

要約

この原稿は、同時に腸球菌属を定量することができる二重デジタルPCRアッセイ。レクリエーション水域における一般的な人間と関連糞便汚染の指標としてHF183遺伝子マーカーを説明しています。

要約

この原稿は、 エンテロコッカス属の同時定量。と人間の糞便関連HF183のマーカーのための二重デジタルPCRアッセイ（EntHF183 DPCR）について説明します。 EntHF183二重DPCR（ここに至ってEntHF183 DPCRと呼ぶ）アッセイは、その公開された個々の定量的PCR（定量PCR）カウンターパートと同じプライマーおよびプローブ配列を使用しています。同様に、前のqPCRに実行されるように、同じ水のろ過とDNA抽出手順はDPCRを実行する前に続いています。しかし、二重DPCRアッセイは定量PCRアッセイを上回るいくつかの利点を有します。最も重要なことは、DPCRアッセイは、そのターゲットの直接定量することにより、それ故に関連するバイアスとばらつきを標準曲線を実行しているとする必要がなくなります。定量PCR（ すなわち同時定量） エンテロコッカスとHF183を二重化しながら加えて、多くの場合、試料中にあまり豊富で、ターゲットの深刻な過小評価につながる、DPCRは、両方のターゲットの一貫性の定量化を提供し、研ぎます彼女は同じ反応で個別にまたは同時に定量しました。 DPCRアッセイはまた、qPCRにより許容されるものよりも1〜2桁であるPCRの阻害剤濃度を許容することができます。それは、同時に2つの別々のqPCRアッセイを実行するために必要とせずに、一般的および環境水における人間関連糞便汚染の両方で、正確で再現性の情報を提供するため、これらの利点は、EntHF183 DPCRアッセイは特に魅力的です。定量PCRを超えるその利点にもかかわらず、現在利用可能な機器とDPCRアッセイの上部定量限界は、定量PCRによって達成可能なものよりも大きさの約4桁低いです。このため、希釈は、通常、汚水の流出後に観察されるような標的生物の高濃度の測定のために必要とされます。

概要

それらは伝統的な培養ベースの方法に比べてより速く、より柔軟かつ特異的であるため、定量的PCR（定量PCR）法が広く娯楽水質監視及び微生物源追跡用途に使用されてきました。その結果、定量PCRは、 エンテロコッカス属などの一般的な糞便指標の急速な水のモニタリング結果を達成するために推奨されている。改訂USEPAレクリエーション水質基準¹で。多くのqPCRアッセイはまた、環境水²に糞便汚染の発生源を特定するために開発および検証されてきました。これらの中でも、HF183マーカーアッセイは、最も頻繁に人間関連糞便汚染^3を識別するため^に使用される一つです。

彼らは定量化のための標準曲線に依存しているためしかし、定量PCRの結果は、多くの場合、バイアスすることができます。定量PCRはスタンから、その定量化サイクル（CQ）を補間することによって、サンプル中の標的の未知の濃度を定量化CQと直列に希釈した標準のセットの対数量との間の線形関係を記述する準の曲線。信頼性と一貫性標準物質の欠如は、したがって、大幅に定量PCRの結果にバイアスをかけることができます。研究は、定量PCRの結果は、異なるベンダー⁴と同じベンダ⁵から規格の異なるバッチを使用して、2倍から標準を使用して約半分のログによって異なっていることを示しました。

デジタルPCR（DPCR）技術は、均一なナノリットルまたはピコリットルの反応⁶の数千または数百万へのバルク定量PCRを分割することによって生成されたミニチュアPCRの大量に陽性の頻度をカウントすることにより、未知試料を定量化します。パーティションは油中水型液滴（ すなわち 、この記事）、またはチップ上の小室であるかどうかは、それぞれ（ すなわち 、この記事）液滴デジタルPCRまたはチャンバデジタルPCR、と呼ばれています。より高い試料濃度は、標的DNAの存在をもたらしますパーティションの高い割合で（したがって、正PCR）、ポアソン分布で近似関係。このように、バイナリ結果（正または負PCR）が記録され、正の液滴の周波数は、定量PCRのような標準曲線のための必要性を排除し、直接ポアソン近似を介して未知試料の濃度を計算するために使用されます。

デジタルPCR定量のこのバイナリ性質は定量PCR ⁷の上に付加的な利点を提供します。遅延増幅がまだ正のPCRを得ることができるので、DPCR定量は、増幅効率を低下させる阻害に対してよりロバストです。定量PCR ^8-10と比較して、DPCRの高精度化につながる、定量PCRである同様に、DPCRの定量化は、Cqの値の変動による影響を受けません。

また、分割処理を効果的amplificatio中（基質競合を最小化する、各小滴中の標的DNAの存在の非常に少量を保証します定量PCR（ すなわちアッセイは、同時に2つのDNA標的を測定）の二重化を実現するための共通の障害となっている別のDNA標的）のn個。このように、二重またはシンプレックスで実行が（ つまり、一つのターゲットは、単一のアッセイで測定された）かどうかDPCRは、両方のターゲット^7,11のほとんど区別できなく定量化を生成します。

この記事で説明したデジタルPCRアッセイ（EntHF183 DPCR）の目標は、一般的な糞便指標腸球菌属の同時直接定量を得ることである。そして改善された精度、再現性および阻害に対するロバスト性を有するヒト、糞便関連HF183マーカーは、その定量PCRと比較します対応。このアッセイは、正常な環境淡水、海水、および種々の糞便物質⁷の糞便汚染を定量するために使用されているだけでなく、水と廃水の任意の他のタイプに適用することができます。このアッセイは、原因それに堆積物や土壌を分析するための非常に有望ですsの阻害に対する高い耐性が、は更なる試験があるため、サンプルのこれらのタイプの中の阻害剤混合物の複雑さが要求されます。

プロトコル

1.アッセイ混合物の準備

1. TE pH8の緩衝液中の全ての分子グレードの水でプライマーおよびプローブ[エンテロF1A、エンテロR1、GPL813TQ ¹²のために100マイクロモル/ Lのストック濃度を作ります。 HF183-1、BthetR1、BthetP1 ^3]。
   注：2のターゲットのためのプローブは、蛍光材料/機器のリストに示されているように異なる蛍光体⁷で標識されています。
2. 反応計画ごとに、混合することにより、マスターミックスを調製する、12μlのデジタルPCRミックス（2回の在庫、材料/機器のリストを参照してください）​​、0.216μlの各フォワードおよびリバースプライマー、0.06各蛍光プローブ、および5.016μlのヌクレアーゼを含まない水μL（最終濃度：900 nMの各プライマー、250nMの各プローブ）。上下ピペット少なくとも10倍溶液に気泡を導入しない注意しながら混合します。
3. 6μlのDNAテンプレートに混合正規のPCRチューブあるいはプレートにピペット（ステップ1.2から）18μlのマスターミックスは、（説明previouとして抽出しますずるい^13）の液滴生成のためのアッセイ混合物を作るために。重複してサンプルを実行している場合は、ピペットマスターミックス36μlの各ウェルに12μlのDNAテンプレート。プレート上の対応する複製ウェルは空のままにしておきます。ポジティブコントロール（ マテリアル/機器のリストを参照）、鋳型なしのコントロール（NTC）（ すなわち 、テンプレートとして使用される分子グレードの水で）が挙げられます。
   注：ポジティブコントロールは、アッセイが正しく実行されており、NTCは、プレート内には汚染がないことを確認し、データ分析の後の蛍光ベースラインを設定する必要があることを確認する必要があります。初めてのユーザーは、希釈されていないと希釈された両方のDNAサンプルを使用することをお勧めします。

2.液滴の生成およびPCRプレートのセットアップ

1. マルチチャンネルピペットを用いてダウンし、約15回ピペッティングすることによりアッセイ混合物を混ぜます。ピペットチップは、混合物内の余分な泡を避けるために液体内に留まることを確認してください。
2. イン（8ウエルを含む）ERTカートリッジ1白カートリッジホルダへとカートリッジホルダシャットをクリックします。カートリッジ1は、しっかりと所定の位置になりましたし、液滴を発生させながらホルダーから外れることはできません。マルチチャンネルピペットを用いて、穏やかに気泡を導入することなく、「サンプル」とマークカートリッジの中間位置にアッセイ混合物の20μLを移します。
3. ピペットは、カートリッジの左側面に液滴生成油の70μl中（ '・オイル "と記されました）。
4. ガスケットはガスケットがフラットと4によって均等に保持されることを確認することでカバーカートリッジは、カートリッジの縁に向かって刻み。カートリッジを開き、配置する液滴発生器の緑色の点灯ボタンを押します。ジェネレータを閉じるために、再度緑色の点灯ボタンを押します。
   注：ドアが閉じると、ボタンが淡色表示され、ドアを再び開くことはできませんし、液滴の生成は、すぐに約1分間継続を開始します。
5. 8つ以上の反応をしている場合は、2番目にカートリッジ2を配置白色カートリッジホルダ液滴発生が全セットアップ時間を節約するために進行中にカートリッジ1と同様に調製。
6. 薄暗い点灯ボタンは、液滴の生成が完了したことを示す緑色に点灯したときに液滴発生器のドアを開きます。 、カートリッジ1を含む白色カートリッジホルダを取り外して脇に置き、及び液滴発生器にカートリッジ2を配置します。
7. カートリッジ1からガスケットを取り外し、廃棄します。静かに熱サイクル用（室温に保持）最終PCRプレートにカートリッジ（ 'ドロップレット "と記された）の第3列から生成された液滴の総容量（約40μl）を転送します。
   注意：新しく生成された液滴を破損する可能性がアクションとして白カートリッジホルダをunclickないでください。液滴が最終プレートに転送された後にのみ、カートリッジホルダを開きます。
8. 繰り返して、追加のサンプルについての2.1から2.7を繰り返します。
9. 全ての液滴が最終PCRプレートにあるとき、穿孔を配置箔は、プレートの上部にカバーし、プレートシーラーの上に置きます。シーラーで180℃、プレス「プレイ」にシーラーを設定し、10秒間のシールをしましょう​​。

3.サーマルサイクリングと液滴読書

1. サーマルサイクラーに密封されたプレートを置き、ステップ2.7で使用される最終的なPCRプレート、および2.0℃/秒の温度ランピング速度と互換性1。
2. 次のように熱プログラムを実行します：10分保持に続いて94℃で30秒間の40サイクル、続いて95℃で10分間、および60℃で60秒、オプションの98°C（で：最終保持を4でか15゜C）。
3. サイクルの完了時に、各ウェル中の各液滴の蛍光を自動測定する液滴リーダーにプレートを転送します。また、液滴の読み取り前まで4℃で3日間プレートを保存。液滴が読書を進める前に、室温であることを確認します。
   1. セットアップに液滴読みを添付ソフトウェアを開きます。に「サンプル、 ''アッセイ1 'と'アッセイ2」：空の96ウェルプレートの概略を含むデフォルトの「セットアップ」メニューには、二重の3セクションを含むメニューを開くために十分A1をクリックしました
   2. 「サンプル」セクションで、「名前」を押して入力するか、またはマークされた右側のボックスチェックラベルされたボックスにサンプルIDを入力し、[適用を」。次に、「実験」の標識ドロップダウンメニューをクリックして、「RED」（まれなイベント検出）を選択し、[Enter]をクリックします。
   3. 「検定1」表記のセクションに移動します「名前」セクションでは、アッセイ（ 例えば 、 腸球菌）を記入し、[Enter]をクリックします。ラベル「タイプ」の下にあるボックスにドロップダウンメニューをクリックし、「チャンネル不明1 'を選択し、[Enter]をクリックします。
   4. 「検定2」表記のセクションに移動します「名前」セクションでは、アッセイ（ 例えば HF183）を記入し、[Enter]をクリックします。ラベル「タイプ」の下にあるボックスにメニューANドロップダウンをクリックします「チャンネル2不明」を選択し、[Enter]をクリックしますdが。 3.3.4へのステップ3.3.2からすべての情報は今もA1に存在しています。
   5. 液滴を含む後続のすべてのウェルに名前を付けます。合計セットアップ時間を節約するために、同時に複数のウェルを選択するには、「Shiftキー」や「Ctrlキーを、]をクリックします。
   6. ときプレートのデジタル描写はメニューの右下の物理的なプレートは、を押して「OK」を反映しています。プレートの概略図の上部に表示される新しいメニューで、[テンプレート]セクションの下の[名前を付けて保存」と名前を選択し、プレートを保存します。
   7. 画面の左側には「ファイル名を指定して実行」をクリックし、ポップアウト」実行オプション」ウィンドウで、適切な色素セットを選択します。データ収集が開始し、ソフトウェアでリアルタイムに表示されます。

4.データ分析とレポーティング

1. リーダーが終了し、ボックスには、「完全なファイル名を指定して実行」を知らせる表示された場合、「OK」をクリックします。
   注意：ソフトウェアは、ソフトウェアの「分析」セクションの下に、最終的なデータファイルが表示されます。このビューでは、ソフトウェアは、「2D振幅」のデータプロットに選択したすべてのプレートのウェルとデフォルト値を持っています。
2. 正と負の液滴間の分離を確認してください。 NTCウェル内のすべての液滴中の蛍光がベースライン近くにあることを確認してください。
3. ラベルの付いたボタンをクリックして「イベント」。提示されたヒストグラムの右側にある「合計」という名前のボックスとウェルあたりに受け入れ液滴の合計数を表示するには、一番下にある「シングル」という名前のボックスをクリックします。 Ctrlキーを押しながら除外されるだけでなく（複数可）をクリックして、<万液滴^7を含む任意のウェルを除外します。
4. 両方のターゲットのNTCウェルにおける負の液滴の上に約1標準偏差（500から700蛍光単位）で蛍光しきい値を設定するには、「1D振幅」と表記ボタンをクリックします。画面アンの非常に左に2つの閾値のボタンを示す「自動分析」DER、それを介して実行しているピンク色の固体の水平ラインを持って右側にあるアイコンを選択します。
5. 振幅の各グラフの下の「設定されたしきい値」の左にあるボックスをクリックし、適切な蛍光閾値の値を入力します。 μlの反応あたりのコピーで標的濃度は、その後、自動的に計算されます。
   注意：しきい値が異なるターゲットのために同一である必要はありません。
6. 1D振幅画面上の左上隅にある[エクスポート]ボタンをクリックして、.csvファイルに結果をエクスポートします。 .csvファイルでは、μlのDNA鋳型あたりのターゲットのコピーにμlの反応ごとターゲットのコピー（ エンテロコッカス属の23S遺伝子。またはHF183マーカー）からそれを変換するために、4によってエクスポートされた目標濃度を掛けます。

結果

良いEntHF183二重DPCRランが受け入れ滴（ 約 10,000-17,000）と負と正の液滴⁷用の蛍光値との間に比較的大きな差（ 約 5000）の比較的多数をもたらすべきです。液滴の異常に低い数は、可能性が高い液滴生成過程での問題を示しており、万液滴のカットオフは、この記事で使用した液滴DPCRシステムからの経験的データに基づいて提案されています。正と...

ディスカッション

プロトコルのいくつかの重要なステップがあります。マスターミックスは、従来の定量PCRマスターミックスよりも粘性であるため、まず、アッセイ混合物の混合が困難な場合があります。単純なボルテックスは、次に、アッセイ混合物中で、その後、液滴にDNA鋳型の不均一な分布をもたらす不十分な混合をもたらすことができます。プロトコールに記載ミキシング・バイ・ピペット操作技術?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.