Дуплексной связи с цифровой ПЦР-анализ для одновременного Количественное определение<em&gt; Enterococcus SPP.</em&gt; И человеческая Фекальные-ассоциированный HF183 Marker в водах

Резюме

Эта рукопись описывает дуплексный цифровой анализ ПЦР , который может использоваться для одновременного количественного определения Enterococcus SPP. И HF183 генетические маркеры , как показатели общего и человеческого ассоциированного фекального загрязнения в рекреационных водах.

Аннотация

Эта рукопись описывает дуплексный цифровой ПЦР (EntHF183 ДПСП) для одновременного количественного определения Enterococcus SPP. И человека фекально-ассоциированной HF183 маркером. EntHF183 дуплекс ДПСП (называемый также EntHF183 ДПСП на этом) анализе используют одни и те же последовательности праймеров и зондов в качестве своих опубликованных индивидуальных количественной ПЦР (КПЦР) экземплярах. Точно так же, те же фильтрации воды и экстракции ДНК процедуры, выполняемые до кПЦР следуют до запуска ДПСП. Тем не менее, дуплекс ДПСП анализ имеет ряд преимуществ по сравнению с КПЦР анализов. Наиболее важно то, что анализ ДПСП устраняет необходимость запуска стандартной кривой, и, следовательно, связанный с ним смещение и изменчивость, путем прямой количественной оценки своих целей. Кроме того, в то время как дуплексной (т.е. одновременное количественное) Enterococcus и HF183 в кПЦР часто приводит к сильному занижению менее обильной мишени в образце, ДПСП обеспечивает последовательное количественное определение обеих целей, подогретьее количественно по отдельности или одновременно в той же самой реакции. Анализ ДПСП также способен переносить концентрации ингибитора ПЦР, которые один-два порядка выше, чем терпимо кПЦР. Эти преимущества делают анализ EntHF183 ДПСП особенно привлекательным, поскольку он одновременно обеспечивает точную и воспроизводимую информацию как общего и человеческого ассоциированных фекального загрязнения окружающей среды в водах без необходимости запуска двух отдельных анализов КПЦР. Несмотря на свои преимущества по сравнению с кПЦР, верхний предел количественного анализа анализа ДПСП с имеющихся в настоящее время приборов примерно на четыре порядка ниже, чем достижимо кПЦР. Следовательно, разбавление необходим для измерения высоких концентраций организмов-мишеней, таких как те, которые обычно наблюдаются следующие канализационные разливы.

Введение

Количественные ПЦР (КПЦР) методы широко используются для рекреационного мониторинга качества воды и микробных отслеживания приложений источник, потому что они быстрее, более гибкими и специфичным по сравнению с традиционными методами культивирования на основе. Следовательно, КПЦР рекомендуется для достижения быстрых результатов мониторинга воды для общих фекальных показателей , таких как Enterococcus SPP. В пересмотренных USEPA критериев качества воды в рекреационных целях ^1. Многие анализы КПЦР также были разработаны и утверждены для выявления источников фекального загрязнения окружающей среды в водах ^2. Среди них HF183 маркер анализы являются одними из наиболее часто используемых для идентификации фекальное загрязнение человеческого ассоциированного ^3.

Тем не менее, результаты КПЦР часто могут быть неточными, так как они опираются на стандартные кривые для количественной оценки. КПЦР квантифицирует неизвестные концентрации мишени в образцах путем интерполяции их количественного определения цикла (Cq) из Стандардскую кривая, которая описывает линейную зависимость между Cq и логарифмическим количеством набора серийно разведенной стандартов. Поэтому отсутствие надежного и последовательного стандартного эталонного материала может значительно смещают результаты КПЦР. Исследования показали , что результаты КПЦР отличались примерно на половину длины бревне эталони- от различных поставщиков ⁴ и 2 раза с использованием разных порций стандартов от того же поставщика ^5.

Цифровые технологии ПЦР (ДПСП) квантифицирует неизвестного образца путем подсчета частоты позитива в большом количестве миниатюрных ДЗП, которые создаются путем разделения насыпную КПЦР на тысячи или миллионы равномерной nanoliter или пиколитра реакций ^6. Это называется , как капельной цифровой ПЦР (то есть, в этой статье) или камере цифровой ПЦР, соответственно, если Перегородки вода-в-масле капли (то есть, в этой статье) или небольшие камеры на чипе. Более высокая концентрация образца будет приводить к наличию ДНК-мишени(Следовательно, положительная ПЦР) в большей пропорции, перегородок, отношения аппроксимируется распределением Пуассона. Таким образом, бинарные результаты (положительный или отрицательный ПЦР) регистрируются и частота положительных капель используется для расчета неизвестных концентраций исследуемого образца непосредственно с помощью приближения Пуассона, устраняя необходимость в стандартной кривой, как в кПЦР.

Этот бинарный характер цифровой ПЦР количественной оценки дает дополнительные преимущества по сравнению с кПЦР ^7. Поскольку задержка амплификации еще может дать положительный результат ПЦР, ДПСП Количественное является более устойчивым по отношению к торможению, что снижает эффективность амплификации. Точно так же, ДПСП Количественное не зависит от изменчивости значений Cq как КПЦР, что приводит к более высокой точности по сравнению с ДПСП кПЦР ^8-10.

Кроме того, процесс разделения обеспечивает очень небольшое количество ДНК, присутствующей мишени в каждой капельке, эффективно сводя к минимуму конкуренцию субстрата (в течение amplificatioп различных мишеней ДНК) , которые являются общими препятствия на пути достижения дуплексную (т.е. анализа одновременно измеряет две мишени ДНК) в кПЦР. Таким образом , работать в дуплексном или симплекс (т.е. одна цель измеряется в одном анализе) ли ДПСП производит почти неотличимы квантификацию обоих мишеней ^7,11.

Целью цифровой ПЦР (EntHF183 DPCR) , описанной в этой статье , чтобы получить одновременное прямое количественное определение общего фекального индикатора Enterococcus SPP. , А человек-фекальные связанный HF183 маркер с улучшенной точностью, воспроизводимости и устойчивости к ингибированию по сравнению с его кПЦР двойники. Этот анализ был успешно использован для количественного определения фекального загрязнения в окружающей пресной воды, морской воды, а также различные фекального материала ^7, но также могут быть применены к любым другим типам вод и сточных водах. Этот анализ имеет большие перспективы для анализа отложений или почв из-за негоS высокая толерантность к торможению, но дальнейшее тестирование требуется из-за сложностей ингибитора смесей в этих типах образцов.

протокол

1. Анализ смеси Приготовление

1. Сделать концентрации 100 мкмоль / л запаса для всех праймеров в классе воды молекулярной и зондов в ТЕ рН 8 буфере [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Примечание: Зонды для двух целей флуоресцентно помечены различными флуорофоров ⁷ , как указано в списке материалов / оборудования.
2. Подготовка мастер смеси путем смешивания, на реакцию и планировалось, 12 мкл цифровой ПЦР смеси (2x запас, см Перечень материалов / оборудования), 0,216 мкл каждого прямого и обратного праймера, 0,06 мкл каждый флуоресцентный зонд, и 5,016 мкл нуклеазы свободной воды (конечная концентрация : 900 нМ каждого праймера, 250 нМ каждого зонда). Пипетировать вверх и вниз, по крайней мере, в 10 раз перемешать, принимая осторожность, чтобы не вводить пузырьков воздуха в растворе.
3. Пипетка 18 мкл основной смеси (со стадии 1.2) в обычной ПЦР трубки или пластины, смешивая в ДНК-матрице 6 мкл (извлеченный, как описано Previouлукавая ¹³⁾ , чтобы сделать смесь для анализа для капельной поколения. При работе образцов в двух экземплярах, пипетка 36 мкл основной смеси и 12 мкл шаблон ДНК в каждую лунку. Оставьте соответствующие повторностей лунки пустыми на тарелку. Включить положительные контрольные (см список материалов / оборудования) и не контролирует шаблон (NTC) (т.е. с водой молекулярного класса , используемого в качестве шаблона).
   Примечание: Положительный контроль необходим для обеспечения анализа работает должным образом, и NTC необходимо обеспечить не существует никакого загрязнения внутри пластины и установить люминесцентную базовую линию позже в анализе данных. Впервые пользователи рекомендуют использовать оба неразбавленных и разбавленных образцов ДНК.

2. Капелька Генерация и установка плиты PCR

1. Смешайте пробирного смеси с помощью пипетки вверх вниз примерно в 15 раз с помощью многоканального пипетку. Убедитесь в том, что наконечник пипетки остается в жидкости, чтобы избежать избытка пузырьков в смеси.
2. InsERT картридж 1 (содержащий 8 лунок) в виде белого держателя картриджа и нажмите держатель картриджа закрыты. Картридж 1 теперь твердо на месте и не может быть смещена из держателя при генерации капель. Используя многоканальную пипетку, аккуратно передать 20 мкл анализируемой смеси в среднее положение картриджа с пометкой "образец" без введения пузырьков воздуха.
3. Пипеткой в ​​70 мкл генерации капель масла на левой стороне картриджа (с надписью «Нефть»).
4. Крышка картриджа с прокладкой убедившись, что прокладка является плоской и удерживается равномерно по 4 клещей к краю картриджа. Нажмите на зеленую кнопку освещенном на генераторе капельным, чтобы открыть и поместить картридж. Нажмите кнопку зеленый свет еще раз, чтобы закрыть генератор.
   Примечание: После того, как дверь закрывается, кнопка недоступна, дверь не может быть возобновлено и генерация капель начинается сразу продолжается в течение примерно 1 мин.
5. Если делать более 8 реакций, место картриджа 2 в секундубелый держатель картриджа и подготовить таким же образом, как и картридж 1, в то время как поколение капелька находится в процессе, чтобы сохранить общее время установки.
6. Откройте дверцу генератора капель, когда кнопка горит тускло горит зеленым цветом указывает на завершение капельным поколения. Удалите белую держатель картриджа, содержащего картридж 1, выделить и поместить картридж 2 на генератор капель.
7. Снимите прокладку из картриджа 1 и выбросить. Аккуратно перенести общий объем (примерно 40 мкл), генерируемых капель из третьей колонки картриджа (с отметкой 'Капельки') на конечную ПЦР пластины (поддерживаемую при комнатной температуре) в течение термического цикла.
   Примечание: Не отключив функцию белый держатель картриджа в качестве действия могут нарушить вновь созданные капель; только открыть держатель картриджа после того, как капли были переданы в окончательной плите.
8. Повторите шаги 2.1-2.7 для дополнительных образцов.
9. Когда все капли в конечной пластине ПЦР, поместите прокалываниюфольга крышки на верхней части пластины и поместите его на тарелку герметиком. Установите герметиком до 180 ° C, нажмите кнопку "Play" на герметиком и пусть печать в течение 10 сек.

3. термоциклирования и капельной Чтение

1. Поместите запечатанную пластину на термоциклеру, один совместимый с конечной пластиной ПЦР, используемого на стадии 2.7, и скорость температуры наращивают 2,0 ° C / сек.
2. Запуск термическую программу следующим образом: 10 мин при 95 ° С, с последующими 40 циклами 30 с при 94 ° С и 60 с при 60 ° С, а затем 10 мин провести при температуре 98 ° С (по выбору: окончательное удержание на 4 или 15 ° С).
3. После завершения езды на велосипеде, передать тарелку в капельку чтения для автоматического измерения флуоресценции в каждой капле в каждую лунку. В качестве альтернативы, храните планшет при 4 ° С в течение 3 дней перед чтением капель. Убедитесь, что капли при комнатной температуре, прежде чем приступить к чтению.
   1. Откройте сопроводительное программное обеспечение для настройки чтения капель. Вменю по умолчанию 'Setup', содержащий схему пустой 96-луночного планшета, дважды щелкните на лунку A1, чтобы открыть меню, содержащее три раздела: "Образец", "Анализ 1 'и' Анализ 2. '
   2. В разделе "Образец" введите образец ID в поле с надписью «Имя» и нажмите клавишу ВВОД или установите флажок справа с надписью «Применить». Затем нажмите выпадающее меню с надписью «Эксперимент» и выбрать «красный» (редкие обнаружения события) и нажмите кнопку ввода.
   3. Перейти в раздел, обозначенном 'Анализ 1.' В разделе "Name" заполнить анализа (например , Enterococcus) и нажмите кнопку ввода. В поле ниже меченого 'Type' выберите в раскрывающемся меню и выберите "Channel 1 Неизвестный" и нажмите кнопку ввода.
   4. Перейти в раздел, обозначенном 'Анализ 2.' В разделе "Name" заполнить анализа (например , HF183) и нажмите кнопку ввода. В поле ниже меченого 'Type' выберите в раскрывающемся меню апd выберите "Channel 2 Unknown 'и нажмите кнопку входа. Вся информация от шагов 3.3.2 до 3.3.4 теперь присутствует в хорошо A1.
   5. Назовите все последующие лунки, содержащие капельки. Чтобы сохранить общее время установки, нажмите клавишу Shift '' или 'Ctrl', чтобы выбрать несколько скважин одновременно.
   6. Когда цифровое изображение пластинки отражает физическую пластину, нажмите 'OK' в нижней правой части меню. В новом меню, которое появляется в верхней части пластины схемы, в соответствии с разделом "Шаблон" выберите "Сохранить как" и имя и сохраните пластину.
   7. В левой части экрана нажмите кнопку "Выполнить" и выберите соответствующий Dye Set в окне Выдвижной "Run Options". Сбор данных инициирует и отображается в режиме реального времени в программном обеспечении.

4. Анализ данных и отчетность

1. Когда читатель закончена и появится окно в котором указывается "Run Complete", нажмите кнопку "OK".
   Примечание: Мягкаяпосуда отображает окончательный файл данных в разделе "Анализ" программного обеспечения. С этой точки зрения, программа имеет все лунки в пластине, выбранные и значения по умолчанию для построения графика данных в "2D амплитудных '.
2. Проверьте расстояние между положительными и отрицательными капельками. Убедитесь в том, что флуоресценция во всех капель в NTC скважин находятся вблизи базового уровня.
3. Нажмите на кнопку с надписью "События". Справа от представленной гистограммы нажмите на поле под названием 'Total' и поле с именем "сингл" в нижней части, чтобы отобразить общее количество принятых капель в каждую лунку. Исключить любые лунки , содержащие <10000 капель ^7, удерживая клавишу Ctrl и нажимая на лунку ( и ) должны быть исключены.
4. Нажмите на кнопку, обозначенном как «1D Amplitude ', чтобы установить люминесцентную порог приблизительно на одно стандартное отклонение (500-700 единицы флуоресценции) выше отрицательных капель в NTC скважин для обеих целей. По крайней левой части экрана ООНМЭД "Auto Проанализировать" показывает два пороговых кнопок, выберите пиктограмму справа, которая имеет прочную розовую горизонтальную линию, проходящую через него.
5. Щелкните в поле слева от 'установленного порогового значения "под каждым из амплитудных графиков и ввести соответствующие пороговые значения флуоресценции. Целевые концентрации в копии на мкл реакции затем вычисляется автоматически.
   Примечание: Пороговые значения не должны быть одинаковыми для различных целей.
6. Экспорт результатов в CSV-файл, нажав на кнопку "Экспорт" в верхнем левом углу на экране 1D Amplitude. В файле .csv, умножать экспортированный концентрацию целевой на 4 , чтобы преобразовать его из копии мишени (23S гена Enterococcus SPP. Или HF183 маркера) за мкл реакции скопировать мишени на мкл ДНК - матрицы.

Результаты

Хороший пробег EntHF183 дуплекс ДПСП должно приводить к относительно большое количество принятых капель (приблизительно 10,000-17,000) и относительно большой разницы (около 5000) между значениями флуоресценции для отрицательных и положительных капель ^7. Необычно...

Обсуждение

Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, смешивание пробирного смесей может быть затруднено, так как основной смеси, включающей более вязкая, чем обычные мастер-смесей КПЦР. Простой вортексе может привести к недостаточному перемешиванию, которое, в свою очередь, приводит к н?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.