Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters

Resumo

Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digital duplex que pode ser utilizado para quantificar simultaneamente Enterococcus spp. E os marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminação fecal humana em geral e associada-em águas de recreio.

Resumo

Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digitais duplex (EntHF183 dPCR) para a quantificação simultânea de Enterococcus spp. E o marcador HF183 fecal-associado humana. O EntHF183 duplex dPCR (referido como EntHF183 dPCR hereon) ensaio utiliza as mesmas sequências de Iniciador e Sonda como as suas congéneres PCR quantitativo (qPCR) individuais publicados. Da mesma forma, os mesmos procedimentos de filtragem de água e extração de DNA como realizados antes da qPCR são seguidos antes de executar dPCR. No entanto, o ensaio dPCR duplex tem várias vantagens sobre os ensaios de qPCR. Mais importante, o ensaio dPCR elimina a necessidade de execução de uma curva padrão e, por conseguinte, a polarização e variabilidade associada, por quantificação directa dos seus alvos. Além disso, embora a impressão duplex (isto é quantificação simultânea) Enterococcus e HF183 em qPCR muitas vezes leva a subestimação grave do alvo menos abundantes em uma amostra, dPCR fornece quantificação consistente de ambos os alvos, aguçarela quantificada individualmente ou simultaneamente na mesma reacção. O ensaio dPCR também é capaz de tolerar concentrações de inibidor de PCR que são uma a duas ordens de magnitude maior do que as toleradas por qPCR. Estas vantagens tornam o ensaio EntHF183 dPCR particularmente atraente porque fornece simultaneamente informações precisas e repetíveis em ambos contaminação geral e associada humano-fecal em águas ambientais, sem a necessidade de executar dois ensaios qPCR separadas. Apesar das suas vantagens sobre qPCR, o limite de quantificação do ensaio superior dPCR com instrumentação actualmente disponível é aproximadamente quatro ordens de grandeza menor do que a alcançável por qPCR. Por conseguinte, a diluição é necessário para a medição de concentrações elevadas de organismos alvo, tais como aqueles tipicamente observado após a derrames de esgoto.

Introdução

Os métodos quantitativos de PCR (qPCR) têm sido amplamente utilizados para a monitorização da qualidade da água de recreio e aplicações de monitorização de origem microbiana, porque eles são mais rápidos, mais flexível e específica em comparação com os métodos baseados em cultura tradicionais. Consequentemente, qPCR é recomendado para a obtenção de resultados de monitorização das águas rápidas para os indicadores fecais gerais, tais como Enterococcus spp. Nos critérios de qualidade revistos USEPA águas de recreio ^1. Muitos ensaios qPCR também têm sido desenvolvidos e validados para a identificação de fontes de contaminação fecal em águas ambientais ^2. Entre estes, os ensaios HF183 marcadores estão entre os mais utilizados para identificar a contaminação fecal associada a ³ humano.

No entanto, os resultados qPCR muitas vezes pode ser tendenciosa, porque dependem de curvas padrão para a quantificação. qPCR quantifica concentrações desconhecidas do alvo em amostras por interpolação seu ciclo de quantificação (CQ) de um standard curva que descreve uma relação linear entre a quantidade Cq e logarítmica de um conjunto de padrões diluído seriadamente. Falta de material de referência confiável e consistente pode, portanto, viés bastante resultados qPCR. Estudos mostraram que os resultados qPCR diferiram em aproximadamente metade de um log usando padrões de diferentes fornecedores ⁴ e por 2 vezes utilizando diferentes lotes de padrões do mesmo fornecedor ^5.

A tecnologia digital PCR (dPCR) quantifica uma amostra desconhecida, contando a frequência de positivos em grande número de PCRs em miniatura que são gerados pelo particionamento de um qPCR em massa para milhares ou milhões de nanoliter uniforme ou reações picolitros ^6. É referido como PCR gota digitais (isto é, neste artigo) ou PCR câmara digital de, respectivamente, se as divisórias são água-em-óleo de gotículas (isto é, neste artigo) ou pequenas câmaras sobre um chip. A concentração da amostra mais elevada resultará na presença de ADN alvo(PCR daí positiva), numa proporção superior das divisórias, uma relação aproximada pela distribuição de Poisson. Como tal, os resultados binários (PCR positiva ou negativa) são registados e a frequência de gotículas de positivos é usado para calcular as concentrações das amostras desconhecidas directamente através de Poisson aproximação, eliminando a necessidade de uma curva padrão como no qPCR.

Esta natureza binária de quantificação PCR digital proporciona vantagens adicionais sobre qPCR ^7. Uma vez que a amplificação atrasada pode ainda produzir um PCR positivo, dPCR quantificação seja mais robusto contra inibição que reduz a eficiência de amplificação. Da mesma forma, dPCR quantificação não é afectado pela variabilidade em valores Cq como é qPCR, levando a uma maior precisão da dPCR em comparação com ^8-10 qPCR.

Além disso, o processo de particionamento garante uma muito pequena quantidade de ADN presente alvo em cada gotícula, minimizando eficazmente competição pelo substrato (durante amplification de alvos diferentes de DNA) que são obstáculos comuns para alcançar duplex (ou seja, um ensaio mede simultaneamente dois alvos de ADN) em qPCR. Como tal, se executado em duplex ou simplex (ou seja, um alvo é medido em um único ensaio) dPCR produz quantificação quase indistinguível de ambos os alvos ^7,11.

O objetivo do ensaio de PCR digitais (EntHF183 dPCR) descrito neste artigo é a obtenção de quantificação direta simultânea do indicador fecal geral Enterococcus spp. E o marcador HF183 humano-fecal associada a uma melhor precisão, reprodutibilidade e robustez contra a inibição em comparação com seu qPCR homólogos. Este ensaio tem sido usado com sucesso para quantificar a contaminação fecal no ambiente de água doce, água do mar, e vários material fecal ^7, mas também pode ser aplicado a quaisquer outros tipos de águas e águas residuais. Este ensaio é uma grande promessa para a análise de sedimentos ou solos devido a eles elevada tolerância à inibição, mas mais testes é necessária devido às complexidades de inibidor mistura nestes tipos de amostras.

Protocolo

1. Ensaio da preparação da mistura

1. Faça concentrações 100 mmol / L de ações para todos os iniciadores em água de grau molecular e sondas em tampão TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Nota: Sondas para os dois alvos são fluorescente etiquetado com diferentes fluoróforos ⁷ como indicados na Lista de materiais / equipamentos.
2. Prepare mistura principal misturando, por reacção planejado, 12 ul digital de mistura de PCR (2x de ações, ver Lista de materiais / equipamentos), 0,216 mL cada um para a frente e primer, 0,06 mL cada sonda fluorescente reversa e 5.016 mL de água livre de nuclease (concentração final : 900 nm cada iniciador, 250 nM cada sonda). Pipeta cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar ao tomar cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução.
3. Pipeta de 18 mL mix master (a partir do passo 1.2) para um tubo de PCR regular ou placa, misturando no modelo de DNA 6 ul (extraído como descrito Previously ¹³⁾ para fazer mistura de ensaio para a geração de gotículas. Se a execução de amostras em duplicado, pipeta 36 ul de mistura principal e 12 molde de ADN em cada poço. Deixe os poços em duplicado correspondentes vazio sobre o prato. Incluir controlos positivos (ver lista de materiais / equipamentos) e não há controles de modelo (NTC) (ou seja, com água de grau molecular usado como modelo).
   Nota: O controlo positivo é necessário para assegurar que o ensaio é executado correctamente e o CNT é necessário para assegurar que não há contaminação dentro do prato e para definir a linha de base fluorescente mais tarde na análise de dados. usuários de primeira vez são recomendados para usar ambas as amostras de DNA não diluídas e diluídas.

2. Geração Gota e configuração da placa PCR

1. Misture as misturas de ensaio pipetando cima para baixo aproximadamente 15 vezes usando uma pipeta multicanal. Certifique-se de que a ponta da pipeta permanece dentro líquido para evitar que bolhas em excesso dentro da mistura.
2. inscartucho de ert 1 (contendo 8 poços) em um suporte de cartucho branco e clique no suporte do cartucho fechada. Cartucho 1 é agora firmemente no lugar e não pode ser desalojado do suporte enquanto que a geração de gotículas. Usando uma pipeta multicanal, gentilmente transferir 20 l de mistura de ensaio para a posição do meio do cartucho marcado "amostra" sem a introdução de bolhas de ar.
3. Pipetar em 70 ul de óleo de geração de gotículas para o lado esquerdo do cartucho (marcado "Óleo").
4. cartucho de tampa com uma junta de vedação para garantir que a junta de vedação é realizada de forma uniforme e plana por a quatro carraças na direcção da extremidade do cartucho. Pressione o botão de luz verde sobre o gerador de gotículas de abrir e coloque o cartucho. Pressione o botão verde iluminado novamente para fechar o gerador.
   Nota: Uma vez que a porta se fecha, o botão fica esmaecido, a porta não pode ser reaberto e geração de gota começa imediatamente continuando por cerca de 1 min.
5. Se fazendo mais de 8 reações, lugar de cartuchos 2 em um segundoo suporte do cartucho e branco preparar da mesma maneira como um cartucho enquanto a geração de gotículas está em andamento para economizar tempo total de instalação.
6. Abra a porta do gerador de gotículas quando o botão dim iluminada fica verde, indicando a conclusão da geração de gotículas. Retire o suporte do branco cartucho contendo cartucho 1, posta de lado, eo cartucho de lugar 2 para o gerador de gota.
7. Remova a junta de cartucho 1 e descarte. Suavemente transferir o volume total (aproximadamente 40 ul) de gotículas geradas a partir da terceira coluna do cartucho (marcado 'Gotas') para uma placa de PCR final (mantido à temperatura ambiente) durante o ciclo térmico.
   Nota: Não desmarque suporte do cartucho de branco como a ação pode quebrar as gotículas recém-gerados; abrir apenas o suporte do cartucho após as gotículas de ter sido transferido para a placa de final.
8. Repita os passos de 2,1-2,7 para amostras adicionais.
9. Quando todas as gotículas são na placa de PCR final, colocar uma perfurávelcobertura de alumínio em cima do prato e coloque-o sobre o selador de placa. Definir o cimento a 180 ° C, prima 'Play' no selador e deixe selo para 10 seg.

3. ciclos térmicos e Leitura Gota

1. Colocar a placa selada no termociclador, um compatível com a placa de PCR final utilizada no passo 2.7, e uma velocidade de rampa de temperatura de 2,0 ° C / seg.
2. Executar programa térmico como se segue: 10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 30 seg a 94 ° C e 60 segundos a 60 ° C, seguido de 10 minutos de espera em 98 ° C (opcional: preensão final em 4 ou 15 ° C).
3. Após a conclusão dos ciclos, transferir a placa para um leitor de gota para a medição automática da fluorescência em cada gota em cada poço. Alternativamente, armazenar a placa a 4 ° C durante até 3 dias antes da leitura das gotículas. Certifique-se as gotas são à temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura.
   1. Abra o software que acompanha a configuração da leitura gota. Dentroo menu padrão 'Setup' contendo um esquema de uma placa de 96 poços vazios, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu que contém três seções: "amostra", "Ensaio 1 'e' Ensaio 2. '
   2. Na seção 'Sample' digite o ID da amostra na caixa chamada "Nome" e pressione enter ou marque a caixa à direita marcado "Aplicar". Em seguida, clique no menu drop-down rotulados 'Experiment' e escolha 'RED' (detecção evento raro) e clique em entrar.
   3. Mover para a seção indicada "Ensaio 1. ' Na seção 'Nome' preencher o ensaio (por exemplo, Enterococcus) e clique em entrar. Na caixa abaixo 'Tipo' rotulado clique no menu drop-down e escolha "Canal 1 Desconhecido" e clique em entrar.
   4. Mover para a seção indicada "Ensaio 2. ' Na seção 'Nome' preencher o ensaio (por exemplo, HF183) e clique em entrar. Na caixa abaixo rotulados 'Tipo', clique no menu suspenso um menud Escolha 'Canal 2 Desconhecido "e clique em entrar. Toda a informação de Passos 3.3.2 a 3.3.4 está presente em bem A1.
   5. Nome todos os poços subsequentes contendo gotículas. Para economizar tempo total de instalação, clique em "Shift" ou "Ctrl", para escolher vários poços simultaneamente.
   6. Quando a representação digital do prato espelha a placa física, pressione "OK" na parte inferior direita do menu. No novo menu que aparece no topo do esquema placa, na seção 'Modelo' escolha 'Salvar como' e o nome e salvar o prato.
   7. À esquerda da tela, clique em "Executar" e escolha apropriada Set Dye em pop-out janela "Opções de Execução" o. A recolha de dados inicia e é exibida em tempo real no software.

4. Análise de Dados e Relatórios

1. Quando o leitor está terminada e uma caixa será exibida informando 'Run Complete', clique em 'OK'.
   Nota: O softWare exibe o arquivo de dados final na seção "Analisar" do software. Neste ponto de vista, o software tem todos os poços na placa selecionados e padrões para trama de dados do '2D Amplitude'.
2. Verifique a separação entre as gotículas positivos e negativos. Assegure-se que a fluorescência em todas as gotículas nos poços NTC estão perto da linha de base.
3. Clique no botão 'Eventos'. À direita do histograma apresentado clique na caixa chamada "Total" ea caixa com o nome "único" na parte inferior para exibir o número total de gotículas aceites por poço. Excluir quaisquer poços contendo <10.000 gotículas ^7, mantendo a tecla Ctrl e clicando sobre o bem (s) a ser excluído.
4. Clique no botão indicado como '1D Amplitude' para definir o limiar de fluorescência a cerca de um desvio padrão (500-700 unidades de fluorescência) acima das gotas negativos em poços NTC para ambas as metas. No lado esquerdo do ecrã under "Analisar Auto 'o que mostra dois botões de limite, escolha o ícone à direita que tem uma linha horizontal rosa contínuo que passa por ele.
5. Clique na caixa à esquerda de "Threshold Definir 'no âmbito de cada um dos gráficos de amplitude e digite os valores de limite de fluorescência apropriados. As concentrações de alvo em cópia por reacção uL são então calculados automaticamente.
   Nota: Os limiares não precisam ser idênticas para os diferentes alvos.
6. Exportar os resultados em um arquivo .csv, clicando no botão "Exportar" no canto superior esquerdo na tela do 1D Amplitude. No arquivo .csv, multiplicar a concentração alvo exportados por 4 a convertê-lo de cópia do alvo (23S gene de Enterococcus spp., Ou o marcador HF183) por reacção ul para copiar da meta per l modelo de DNA.

Resultados

Um bom EntHF183 duplex dPCR execução deve resultar em número relativamente elevado de gotículas aceites (cerca de 10,000-17,000) e diferença relativamente grande (cerca de 5,000) entre os valores de fluorescência para gotas negativos e positivos ^7. Invulgarmente baixo número de gotículas provavelmente indica problemas no processo de geração de gotículas, e um limite de exclusão de 10.000 gotículas é sugerida com base em dados empíricos do siste...

Discussão

Existem algumas etapas críticas do protocolo. Em primeiro lugar, a mistura das misturas de ensaio pode ser difícil, porque a mistura principal é mais viscoso do que misturas principais qPCR convencionais. vórtex simples pode levar a uma mistura insuficiente, o que conduz por sua vez à distribuição não uniforme de moldes de ADN nas misturas de ensaio e posteriormente nas gotículas. A técnica de mistura-por-pipetagem descrito no protocolo deve ser seguido para garantir a quantificação precisa dPCR. Em segundo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.