Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; Spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

Summary

כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת spp אנטרוקוקוס זמנית. ואת סמנים גנטיים HF183 כאינדיקטורים לזיהום צואתי כללית אדם הקשורים במים פנאי.

Abstract

כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס (EntHF183 dPCR) כימות סימולטני של spp אנטרוקוקוס. ואת סמן HF183 צואה הקשורים האדם. EntHF183 דופלקס dPCR (המכונה בשם EntHF183 dPCR hereon) assay משתמשת באותו רצפים פריימר בדיקה כמו PCR כמותי הפרט שפורסם שלה (qPCR) עמיתיהם. כמו כן, אותם הליכי סינון מי מיצוי DNA כפי שבוצע לפני qPCR הם אחריו לפני הפעלת dPCR. עם זאת, assay דופלקס dPCR יש מספר יתרונות על פני מבחני qPCR. החשוב ביותר, assay dPCR מבטל את הצורך לרוץ עקומת סטנדרט ומכאן, ההטיה הקשורה ולהבדלים, על ידי כימות ישיר של מטרותיה. בנוסף, בעוד להדפסה דו-צדדי (כלומר כימות סימולטני) אנטרוקוקוס ו HF183 ב qPCR מוביל לעתים קרובות הערכה נמוכה מדי חמורה של היעד השופע פחות במדגם, dPCR מספק כימות עקבית של המטרות הן, לגרותלה לכמת בנפרד או בו-זמנית באותו התגובה. את assay dPCR הוא גם מסוגל לסבול ריכוזי מעכב PCR כי הם אחד שני סדרי גודל גבוה יותר מאלו נסבלים על ידי qPCR. יתרונות אלו הופכים את assay EntHF183 dPCR אטרקטיבי במיוחד משום שהיא בעת ובעונה אחת מספקת מידע מדויק דיר משני הזיהום הכללי ואנושיים הקשורים צואתי במי סביבה, ללא הצורך להפעיל שני מבחני qPCR נפרדים. למרות יתרונותיה מעל qPCR, מגבלת הכימות העליונה של assay dPCR עם מכשור הקיימות כיום כ ארבעה סדרי גודל נמוך מזה השגה על ידי qPCR. כתוצאה מכך, הדילול נדרש למדידת ריכוזים גבוהים של אורגניזמים היעד כגון אלו שנצפו בדרך כלל בעקבות נשפך ביוב.

Introduction

PCR כמוני (qPCR) שיטות כבר בשימוש נרחב לניטור איכות מי פנאים ויישומי מעקב מקור חיידקים כי הם מהירים יותר, גמישים יותר ספציפיים בהשוואה לשיטות תרבות המבוססת מסורתיות. כתוצאה מכך, qPCR מומלץ להשגת תוצאות ניטור מים מהירות עבור אינדיקטורים צואתי כלליים כגון spp אנטרוקוקוס. בקריטריוני איכות מי פנאי מתוקן USEPA ^1. מבחני qPCR רבים גם פותחו ומאומתים לזיהוי מקורות זיהום צואתי במי סביבת ^2. בין אלה, מבחני סמן HF183 הם בין הנפוצות ביותר בשימוש לזיהוי זיהום צואתי הקשורים האדם ^3.

עם זאת, תוצאות qPCR יכול לעיתים קרובות להיות מוטים כי הם מסתמכים על עקומות סטנדרטיות עבור כימות. qPCR מכמת ריכוזים ידועים של יעד בדגימות על ידי ביון מחזור הכימות שלהם (CQ) מתוך סטןעקומת dard המתארת ​​מערכת יחסים ליניארי בין Cq וכמות לוגריתמים של סט של סטנדרטים בדילול סדרתי. חוסר חומר עזר תקן אמין ועקבי ולכן יכול להטות תוצאות qPCR מאוד. מחקרים הראו כי תוצאות qPCR שונות על ידי כחצי סטנדרטי יומן באמצעות מיצרנים שונים ⁴ ועל ידי 2-לקפל באמצעות קבוצות שונות של סטנדרטים מאותו הספק ^5.

PCR דיגיטלי (dPCR) טכנולוגיה מכמתת מדגם לא ידוע על ידי ספירת התדירות חיובית במספרים גדולים של PCRs מיניאטורי המופקים על ידי מחיצות qPCR בתפזורת לתוך אלף או מ'nanoliter האחיד או תגובות picoliter ^6. זה נקרא כמו אגל PCR דיגיטלי (כלומר, במאמר זה) או תא דיגיטלי PCR, בהתאמה, אם המחיצות הן טיפות מים ב-שמן (כלומר, במאמר זה) או תא קטן על שבב. ריכוז מדגם גבוה יגרום נוכחות של DNA היעד(ומכאן חיובי PCR), בשיעור גבוה יותר של מחיצות, מערכת יחסים המקורבים על ידי התפלגות פואסון. ככזה, התוצאות בינארי (חיובי או שלילי PCR) נרשמות ואת התדירות של טיפות חיוביות משמשת לחישוב ריכוזים מדגמים לא ידועים ישירות דרך קירוב פואסון, ביטול הצורך עקום סטנדרט כמו qPCR.

הטבע בינארי זה של כימות דיגיטלי PCR מספק יתרונות נוספים על פני qPCR ^7. בגלל הגברה מתעכבת עדיין יכולה להניב PCR חיובי, כימות dPCR הן חזקות יותר נגד עיכוב המפחיתה יעילה הגברה. באופן דומה, כימות dPCR אינו מושפע השתנות בערכים Cq כמו qPCR, שמוביל דיוק גבוה של dPCR לעומת qPCR ^8-10.

בנוסף, תהליך יצירת המחיצות מבטיח כמות קטנה מאוד של הנוכחי DNA יעד בכל אגל, מזעור תחרות מצע ביעילות (במהלך amplification של מטרות DNA שונות) כי הם מכשולים נפוצים להשגת דופלקס (כלומר assay מודד בעת ובעונה אחת שתי מטרות DNA) qPCR. ככזה, אם בטווח בדופלקס או סימפלקס (כלומר יעד אחד נמדד ב assay אחת) dPCR מייצרת כימות כמעט נבדלות של שני היעדים ^7,11.

המטרה של assay PCR הדיגיטלי (EntHF183 dPCR) המתוארת במאמר זה היא להשיג כימות ישירה סימולטני של spp אנטרוקוקוס מחוון צואתי הכללי. ואת סמן HF183 הקשורים אדם-צואה עם דיוק, שחזור וחוסנם משופרים מפני עיכוב לעומת qPCR שלה עמיתים. Assay זה נוצל בהצלחה לכימות זיהום צואתי במים מתוקים סביבה, מים ימיים, חומר צואתי שונה ^7, אבל יכול גם להיות מיושם על כל סוגים אחרים של מים ואת wastewaters. assay זה טומן בחובו הבטחה גדולה לניתוח משקע או קרקעות בגלל זהזה סובלנות גבוהה עיכוב, אך בדיקות נוספות נדרשות בשל מורכבות של המעכב מתערבב סוגים אלה של דגימות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תערובת Assay כן

1. הפוך 100 μmol / L ריכוזי מניות לכל פריימרים במי כיתה מולקולריים בדיקות במאגר TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   הערה: בדיקות עבור שתי המטרות מסומנות fluorescently עם ⁷ fluorophores השונים כמצוין רשימה של חומרים / ציוד.
2. הכינו תערובת אמן על ידי ערבוב, לכל תגובה מתוכננת, 12 μl דיגיטלי תמהיל PCR (2x המניות, ראה רשימה של חומרים / ציוד), 0.216 μl כל קדימה לאחור תחל, 0.06 μl כל בדיקה ניאון, ו 5.016 μl מים nuclease חינם (הריכוז הסופי : פריימר 900 ננומטר כל, 250 ננומטר כל בדיקה). פיפטה מעלה ומטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב תוך זהירות שלא להכניס בועות אוויר בתמיסה.
3. פיפטה 18 μl תערובת אמן (משלב 1.2) לתוך צינור או צלחת PCR רגיל, ערבוב תבנית ה- DNA 6 μl (חילוץ כמתואר לשנים קודמותערמומי ¹³⁾ לעשות תערובת assay עבור דור אגל. אם פועל דגימות בשני עותקים, pipet 36 μl של תמהיל מאסטר ו -12 תבנית ה- DNA μl לבאר כל אחד. השאר את הבארות לשכפל המקביל ריק על הצלחת. כלול בקרות חיוביות (ראה רשימה של חומרים / ציוד) ולא שולט תבנית (NTC) (כלומר עם מי כיתה מולקולריים משמשים תבנית).
   הערה: בקרה חיובית יש צורך להבטיח את assay פועל כראוי ואת NTC יש צורך להבטיח שאין זיהום בתוך הצלחת ולהגדרת בסיס הניאון בהמשך לניתוח נתונים. משתמשים פעם ראשונה מומלץ להשתמש בשתי דגימות DNA חי ומדולל.

2. דור אגל והגדרת פלייט PCR

1. מערבבים את תערובת assay ידי pipetting למעלה למטה כ 15 פעמים באמצעות pipet הרב ערוצית. ודא קצה pipet נשאר בתוך נוזל, כדי למנוע עושה בועות עודפות בתוך התערובת.
2. insמחסנית ERT 1 (המכיל 8 בארות) לתוך בעל מחסנית לבן ולחץ על עצומות בעל מחסנית. מחסנית 1 כיום במקומו ולא ניתן וחילצה מבעל תוך יצירת טיפות. שימוש pipet הרב ערוצית, להעביר בעדינות 20 μl של תערובת assay לתוך האמצע של "מדגם" מסומן מחסנית ללא החדרת בועות אוויר.
3. Pipet ב 70 μl של שמן אגל דור אל הצד השמאלי של מחסנית (מסומן 'שמן').
4. מחסנית כיסוי עם אטם מוודא האטם הוא שטוח וקבע באופן שווה על ידי 4 קרציות לעבר קצה המחסנית. לחצו על הכפתור הירוק מואר על הגנרטור אגל לפתוח ולמקם את המחסנית. לחץ ירוק מואר הלחצן שוב כדי לסגור את הגנרטור.
   הערה: לאחר שהדלת נסגרת, הלחצן מעומעם, הדלת לא ניתן לפתוח מחדש ודור אגל מתחיל ממשיך מיד כ 1 דקות.
5. אם עושים יותר מ -8 תגובות, מחסנית מקום 2 תוך שנייהבעל מחסנית לבן ולהכין באותו אופן כמו מחסנית 1 ואילו דור האגל מתבצע כדי לחסוך זמן התקנה כולל.
6. פתח את דלת גנרטור אגל כאשר הכפתור מואר העמום הופך ירוק המציין השלים דור אגל. הסר את בעל מחסנית לבן המכיל מחסנית 1, להפריש, ומקום מחסנית 2 על גנרטור רביב.
7. הסר את האטם ממחסנית 1 וזורקים. בעדינות להעביר את הנפח הכולל (כ 40 μl) של טיפות שנוצרו מן בטור השלישי של המחסנית (מסומן 'טיפות') לצלחת PCR סופית (נשמרה בטמפרטורת חדר) עבור רכיבה תרמית.
   הערה: אל ובטל את בעל מחסנית הלבן כמו הפעולה עשוי לשבור את הטיפין החדשות שנוצרו באופן מלאכותי; רק לפתוח את בעל המחסנית אחרי הטיפין הועברו הצלחת הסופית.
8. חזור על שלבים 2.1-2.7 עבור דגימות נוספות.
9. כשכל הטיפין נמצאות צלחת PCR הסופית, להציב לנקבהכיסוי רדיד על גבי צלחת ומניחים אותו על אוטם צלחת. הגדר את האוטם ל -180 ° C, לחץ על 'Play' על האוטם ולתת חותמים במשך 10 שניות.

3. רכיבה על אופניים תרמיים וקריאת האגל

1. מניח את הצלחת האטומה על Cycler התרמית, אחד בקנה אחד עם צלחת PCR הסופית המשמשת בשלב 2.7, ומהירות ramping טמפרטורה של 2.0 מעלות צלזיוס / sec.
2. הפעל תכנית תרמית כדלקמן: 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ואחריו 40 מחזורים של 30 שניות על 94 מעלות צלזיוס ו -60 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ואחריו להחזיק 10 דקות ב 98 ° C (אופציונאלי: עצירה סופית ב 4 או 15 ° C).
3. עם השלמת אופניים, להעביר את הצלחת לקורא אגל למדידה אוטומטית של קרינה בכל אגל בכל טוב. לחלופין, אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים לפני קריאת רביב. ודא הטיפות הן בטמפרטורת החדר לפני שתמשיך עם הקריאה.
   1. פתח בתוכנה הנלווית התקנת קריאת רביב. בתפריט ברירת המחדל 'הגדרת' המכיל סכמטי של צלחת ריקה 96 באר, לחץ לחיצה כפולה על כן A1 כדי לפתוח את התפריט המכיל שלושה חלקים: "לדוגמא, '' Assay 1 'ו' Assay 2."
   2. בקטע 'לדוגמא' הקלד את מזהה המדגם לתוך התיבה שכותרתה 'שם' ולחצו אנטר או לסמן את התיבה בצד ימין מסומן 'החל'. לאחר מכן, לחץ הנפתח 'ניסוי' שכותרתו תפריט ולבחור "RED" (זיהוי אירוע נדיר) ולחץ על Enter.
   3. לעבור לקטע כונה 'Assay 1.' בקטע 'שם' למלא את assay (למשל אנטרוקוקוס) ולחץ על Enter. בתיבת הדו למטה תחת הכותרת "סוג" לחץ על התפריט הנפתח ובחר 'ערוץ 1 לא ידוע' ולחץ על Enter.
   4. לעבור לקטע כונה 'Assay 2. " בקטע 'שם' למלא את assay (למשל HF183) ולחץ על Enter. בתיבת הדו למטה תחת הכותרת "סוג" לחץ הנפתחת תפריטd לבחור "ערוץ 2 לא ידוע 'ולחץ על Enter. כל המידע מן השלבים 3.3.2 עד 3.3.4 עכשיו להציג היטב A1.
   5. שם כל הבארות הבאות המכילות טיפות. כדי לחסוך זמן התקנה כולל, לחץ על 'Shift' או 'Ctrl' לבחור בארות בו זמנית.
   6. כאשר התיאור הדיגיטלי של צלחת מראות הצלחת הגופנית, לחץ על 'האישור' בפינה הימנית התחתונה של התפריט. בתפריט החדש שמופיע בחלק העליון של סכמטית הצלחת, תחת הסעיף 'Template' לבחור 'שמירה בשם' ושם ולשמור הצלחת.
   7. כדי השמאלי של המסך ולחץ על 'הפעל' ובחר מתאים דיי סט ב-אאוט פופ "הפעלת האפשרויות" החלון. איסוף נתונים יוזם מוצג בזמן אמת בתוכנה.

4. ניתוח נתונים ודיווח

1. כאשר הקורא הוא סיים תופיע תיבה והצהירה "מפעיל שלמים ', לחץ על' אישור '.
   הערה: רכהכלי מציג את קובץ הנתונים הסופיים, בסעיף 'לנתח' של התוכנה. לפי השקפה זו, התוכנה יש את כל הבארות בצלחת שנבחרו מחדל לעלילת הנתונים ד'2 Amplitude '.
2. בדוק את ההפרדה בין הטיפות חיוביות ושליליות. ודא כי הקרינה בכל טיפות בבארות NTC נמצאים בקרבת הבסיס.
3. הקישו על כפתור הנקרא 'אירועים'. מהימין של ההיסטוגרמה הציג לחץ על התיבה בשם 'סה"כ' והתיבה בשם "יחיד" בתחתית כדי להציג את המספר הכולל של טיפות קבלו בכל טוב. אל תכלול כל בארות המכילות <10,000 טיפות ^7-ידי החזקת מקש Ctrl ולחיצה על הבאר (ים) כדי להיות שליליות.
4. לחץ על הכפתור המסומן כמו '1D Amplitude' כדי לקבוע את סף פלורסנט בכ סטיית תקן אחת (500-700 יחידות קרינה) מעל הטיפין השליליות בבארות NTC עבור מטרות שניהם. במקרה הטוב ביותר השמאלי של האו"ם המסךדער את 'אוטומטי לנתח ו"הראתה שני כפתורי סף, לבחור את הסמל בצד ימין כי יש קו אופקי ורוד מוצק רץ דרך אותה.
5. לחץ בתיבה מהשמאל 'קבע סף' תחת כל הגרפים משרעת והזן את ערכי סף הקרינה המתאימים. ריכוזי היעד להעתיק לכל תגובת μl אז מחושבים באופן אוטומטי.
   הערה: ספי לא צריך להיות זהה עבור מטרות שונות.
6. לייצא את התוצאות לקובץ csv על ידי לחיצה על כפתור "ייצוא" בפינה השמאלית העליונה במסך 1D משרעת. בקובץ CSV, להכפיל את הריכוז היעד שמייצאת 4 להמיר אותו מעותק של היעד (23S הגן של spp אנטרוקוקוס. או על סמן HF183) לכל תגובה μl להעתיק של היעד לכל μl תבנית ה- DNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ריצת דופלקס EntHF183 טובה dPCR צריכה לגרום למספר גבוה היחסי של טיפות קבלו (בערך 10,000-17,000) והבדל גדול יחסית (בערך 5,000) בין ערכי קרינה עבור טיפות שליליות וחיוביות ^7. באופן חריג מספר נמוך של טיפות מציין בעיות קרוב בתהליך אגל הדור, וניתוק 10,000 טיפות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנם כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, ערבוב של תערובות assay יכול להיות קשה, כי את תערובת מאסטר היא צמיגה יותר מאשר תערובות מאסטר qPCR קונבנציונליות. vortexing פשוט עלול להוביל ערבוב מספיק, אשר בתורו מוביל הפצה לא אחידה של תבניות DNA של תערובות assay וכפועל יוצא מזה הטיפות. טכני...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.