全自动离心微流体装置从全血超灵敏蛋白检测

摘要

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

摘要

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO₂ nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO₂ NF mat; transfer-printing of TiO₂ NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

引言

基于纳米材料^的1,2-如纳米线^，3纳米颗粒^，4纳米管^，5和纳米纤维^（NFS）6-8疾病诊断多种平台已经制定出来。这些纳米材料提供新技术的设计，由于其独特的物理化学性质高度敏感的生物测定极好的前景。例如，氧化物中孔锌纳米纤维已经被用于乳腺癌的生物标志物的毫微微摩尔灵敏的检测^。9最近，基于二氧化钛（TiO _2）已探索生物分析应用¹⁰考虑到它们的化学稳定性的纳米材料^，11微不足道蛋白质变性^，12和生物相容性^。13另外， _二氧化钛的表面上的羟基基团促进 ​​化学修饰和生物分子的共价连接^。14,15图案化_的 TiO ₂ THIN薄膜¹⁶或TiO ₂纳米管¹⁷已被用于通过增加表面积以增强靶蛋白的检测灵敏度;然而，制造工艺是相当复杂的，并且需要昂贵的设备。另一方面，静电会员协会受到关注，因为它们的高表面积以及简单和低成本的制造过程; ^18,19然而，该静电_的 TiO ₂的NF垫的易碎或松散特性使得它难以处理和与微流体装置因此集成^。6,20，在TiO ₂的NF垫中的生物分析应用很少使用，特别是那些需要苛刻的洗涤条件。

在这项研究中，要克服这些限制，我们已经开发出一种新技术，用于通过利用​​一个薄聚二甲基硅氧烷（PDMS）粘合剂层的静电NF垫转印到任何目标衬底的表面上。 Furthermore，我们已经成功地显示出静电_的 TiO ₂的NF垫的整合到由聚碳酸酯（PC）的离心微流体装置。使用这种装置，高敏感的，完全自动化，并集成检测C-反应蛋白（CRP）以及心肌肌钙蛋白I（cTnI水平）溶液在30分钟内从仅10微升的全血²¹来实现的。由于该组合NFS和离心平台的性能优势，该测定显示出六个数量级的宽动态范围从1微克/毫升（〜8 FM）到100纳克/毫升（〜下午12点08分）与检测的下限0.8微克/毫升（〜6 FM）为CRP和100纳克/毫升（〜4纳米）为37微克/毫升（〜下午1点05分）的检测限的动态范围从10微克/毫升（~0.4 PM） cTnI浓度。这些检测限〜300和〜20倍下相比，他们的相应的常规ELISA结果。这种技术可应用于用于检测任何靶蛋白，用适当的抗体。总体来说，这款设备合作ULD大大有助于在体外诊断和生物化学试验，因为它可以从非常少量的生物样品甚至检测罕见量的靶蛋白具有高度的敏感性; 例如 ，10微升的全血。尽管我们仅展示在这项研究中使用ELISA血清蛋白的检测，静电会员协会与微流体设备的传输和集成技术，可以更广泛地用于需要高检测灵敏度大表面积其他生化反应的应用。

研究方案

注:血从健康个体抽取并收集在一个血液收集管。所有志愿者签署知情同意书。

1. _二氧化钛NF垫的研制

1. 的前体溶液 ²² 制备
   1. 溶解1.5克在乙醇（99.9％，3毫升）和冰醋酸（3毫升）的混合物四异丙醇钛（TTIP），并在磁力搅拌器上在RT（25℃）30分钟的溶液混合。
   2. 溶解在3.64克的乙醇（99.9％）聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）的11％（重量），并用热板磁力搅拌器搅拌，在65℃下该溶液1小时。
   3. 结合并搅拌在65℃下将两种溶液，在热板磁力搅拌器4小时。
2. 静电
   1. 加载制备溶液成连接到200μm内diame的不锈钢针的注射器之三。除去柱塞后倾直接溶液进入注射器。
   2. 不断推出该溶液在在高DC电压（15千伏）放置在接地的基底为0.3毫升/小时10分钟的流速到Si晶片（2毫升×2厘米）。在电纺丝中，设置在针和接地衬底到10厘米之间的距离。
3. 在NF垫煅烧
   1. 放置的NF垫在炉中，以3℃/分钟的高真空条件下（5×10 ^-5托 ​​）下一个斜坡速率增加温度高达500℃。
   2. 保持在500℃的温度下3小时。在炉内冷却样品至室温（25℃）的温度。

2.二氧化钛的集成₂ NF垫成一个微流控离心光盘

1. 盘的制造
   1. 使用3D设计软件（ 例如 ，索尔idWorks或类似）来描绘腔室，通道，或光盘的各层的阀门。使用代码生成软件（ 例如 ，Edgecam公司或类似）转换的设计文件到计算机数控（CNC）的代码。根据说明书使用软件说明书^23,24注:本设备中使用的典型的通道尺寸为1.0毫米×0.3毫米（宽x深）。
   2. 开放式数控铣床的操作软件（ 例如 ， DeskCNC或类似）并装载数控代码，操作软件，然后点击为了如下:"AUTO" - >"G代码OPEN" - >选择生成数控代码。
   3. 装上数控铣床上的PC板:选用1 mm印刷板为光盘层顶层5毫米PC板。运行数控铣床通过点击"开始"按钮剪切光盘的各层。
2. _的 TiO ₂ 的NF垫 转移 到盘
   1. 放置一个硅衬底和含有40微升（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）-1-三氯硅烷在真空条件下的真空室30分钟小培养皿。所述氟硅烷蒸发并得到涂布在基材上。
   2. 混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与10的固化剂:1的比例和脱气在一个真空室中。旋涂的PDMS到在650的转速为60秒的硅衬底。
   3. 固化在烘箱中涂覆的硅基材上的PDMS在65℃下10分钟以实现粘附的状态。
      注:固化时间可根据环境条件而改变，粘附力可通过使用流变仪一粘性试验进行测试。
   4. 传输通过静电和煅烧制得的_二氧化钛NF垫子上使用镊子涂PDMS硅。然后，手动应用的转移TiO ₂的NF垫的保形压力带平面物体（ 例如 ，载玻片），并取出异物。放该样品在烘箱中在65℃下4小时或在80℃1小时以完全固化的PDMS层。
   5. 在20微升的PDMS /固化剂混合物在盘涂层结合反应室（10:1），其充当粘合剂层对于TiO ₂的NF垫附着在盘上。
   6. 分配50微升上的PDMS层上的_二氧化钛的NF垫乙醇（99.9％），切开的NF垫用6毫米直径的冲头孔，和TiO ₂的NF垫传送切涂有20微升结合反应室在先前步骤中的PDMS。
      注意:在此步骤中，乙醇将有助于从Si衬底分离切断_的 TiO ₂的NF垫。
   7. 孵育在烘箱中_的 TiO ₂的NF垫集成圆盘在65℃下4小时或在80℃1小时以完全固化的PDMS。
3. 在盘上 的_二氧化钛 的NF垫 的表面改性
   1. P在乙醇（3-环氧丙氧基丙基）甲基二硅烷（GPDES）的repare 1％体积/体积溶液（99.9％）。
   2. 治疗用氧等离子体在TiO ₂的NF垫集成圆盘在140瓦，180秒为50sccm氧气流。分配每个纳米纤维垫100微升GPDES溶液，并在室温（25℃）孵育2小时。
   3. 洗用洗瓶分配乙醇（99.9％）的底物短暂地，然后通过反向盘和印迹它与干净擦拭完全除去乙醇。固化在80℃下1小时。用相同的方式乙醇（99.9％）洗涤两次，如上所述，以除去物理吸附的和未结合GPDES分子。
   4. 吹干用氮气流，在真空下干燥。
      注:该光盘可以在RT（25℃）贮存在密封容器中直至使用。
4. 的表面上的抗体的固定化
   1. 使200微克/毫升捕获的抗体的溶液（单克隆小鼠抗人C反应蛋白或者由稀释用磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液（pH 7.4）中的抗体的单克隆小鼠抗cTnI）。免除5微升用微量中盘解决方案到每个NF垫。请参阅材料清单有关抗体的更多信息。
   2. 保持光盘在湿润室中，并在37°C孵育4小时。洗涂的NF垫用0.1％BSA-PBS缓冲液中的抗体。填充使用微量洗涤缓冲液100微升室，由要把孔内的缓冲区。最后，反转光盘并吸干对清洁擦拭，然后组装光盘。
5. 盘总成
   1. 绘制使用CAD程序（ 例如 ，AutoCAD或类似）上双面胶带盘的设计。启动CAD设计到刻字机。
   2. 切使用切割机的双面胶带。揭下双面胶带的一个保护层，并附加我T于光盘层的顶部。剥离其他保护层和盘层上附着的顶层。
   3. 加载预先组装盘的压制机和精确地对准使用每个层对齐标记来连接每个阀，通道和腔室顶部/粘合剂/光盘层。使用压面机应用适形压力。

3.免疫

1. 补使用微量用1％BSA-PBS缓冲液的室中，并在37°C孵育盘1小时。通过使用微量吸液除去缓冲区。执行此步骤以阻止未反应位点，并减少在盘蛋白质的非特异性吸附。
2. 通过填充和使用微量吸移室用0.1％BSA-PBS洗涤两次。
   注意:在这个阶段，盘可以储存在4℃直至使用。
3. 负载10的抗原掺入的全血或无CRP血清为在盘上的CRP检测微升使用micropipett即用于制备校准曲线，使用的CRP的浓度从1微克/毫升到100纳克/毫升;和肌钙蛋白从10微克/ ml至100ng / ml的。
   注意:由于在更高的水平在全血，这通常是在μM范围的CRP，无CRP的血清被用于证明所述装置的检测下限。
4. 旋转盘在3600转（391 XG）60秒以分离红细胞。
5. 开阀＃1通过激光照射，并传送4微升上清液血浆到包含8微升的由2400转速旋转光盘3秒检测与HRP缀合的抗体的腔室。
   注意:阀门驱动和盘操作的可视化的一般流程进行了详细以往报告中描述的²¹
6. 适用的混合模式（15赫兹^-1，15°）为5秒的蛋白质和检测抗体的结合。
7. 开阀＃2，并且在步骤6中制备的混合物转移到结合反应室（2 400转，3秒）。然后，应用一个混合模式（60赫兹^{-1，2°）20}分钟以实现所述混合物并在TiO ₂的会员协会的结合的抗体之间的免疫反应。该反应中，开阀＃3后，残余的混合物转移到废物腔室（2 400转，10秒）。
8. 通过打开阀＃4和纺丝盘（2 400转，4秒）传送洗涤缓冲液（600微升）到结合反应室中。然后进行120秒的应用混合模式（30赫兹^-1，30°）洗涤_二氧化钛会员协会在腔室。
9. 通过以下步骤3.8的相同的条件下洗涤_的 TiO ₂会员协会两次，并通过2400转速旋转光盘20秒完全除去剩余的洗涤缓冲液。然后，关闭阀门＃5。
10. 对于化学发光反应，时间为1分钟施加一个混合模式（30赫兹^-1，2°）通过打开阀＃6和纺丝的化学发光底物溶液，以结合反应室转印后盘2400转，持续10秒之后。
11. 通过打开阀＃7和2400的转速旋转光盘10秒转移反应的底物溶液到检测腔室。
12. 测量使用的光电倍增管（PMT）模块装备检测系统反应的底物溶液的化学发光信号。
    注:该检测系统是使用以下部分的定制机器:步进电机，光学机械组件，翻译阶段，并且可商购的PMT。的光学机械部件和步进电机组装到保持装置，并且该电机能转动盘。该检测是通过光电倍增管进行固定在光学机械部件，它位于上述装置的检测腔室。通过操纵步进电机，检测腔室的正下方PMT的检测区对齐。

结果

使用该协议，从全血中的高灵敏度制备蛋白质检测一个完全自动化的离心微流体装置。在TiO ₂的NF垫由静电和煅烧的方法制备。为了制造所需直径，形态和厚度的NFS，静电如流量，电压，和纺纱的时间条件进行了优化。当条件不优化，形成在NFS的质量很差。特别是，NFS未从在低电压（5千伏）的聚合物溶液纺出，并且当电压为高被打破（> 20千伏）。同样，纺纱时?...

讨论

TiO ₂的NF集成光盘上的检测是存在于血液量非常低低丰度蛋白进行超灵敏检测快速，廉价和方便的技术。该技术具有使用小样品体积（10微升）的优点，并且是适合用于同时多个样品的分析。这提供了巨大的潜力作为一个复用免疫测定装置。该装置具有附加的优点，它不需要像血浆分离，这需要在常规的ELISA样品预处理步骤。此外，该设备可以执行整个免疫测定程序自动地（ 例如 ，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	LG SILTRON	Polished Wafer, test grade	Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)	Daedong Plastic	PCS#6900	Thickness (mm) = 1 and 5
Titanium tetraisopropoxide, 98%,	Sigma-Aldrich	205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000	Sigma-Aldrich	437190
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Anhydrous ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS and curing agent	Dow Corning	SYLGARD 184
GPDES	Gelest Inc	SIG5832.0
Ethanol	J T Baker
FE-SEM	FEI	Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy	ThermoFisher	K-alpha
3D modeling machine	M&I CNC Lab, Korea		CNC milling machine
Wax-dispensing machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Double-sided adhesive tape	FLEXcon, USA	DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter	Graphtec Corporation, Japan	Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater	MIDAS	SPIN-3000D
Furnace (calcination)	R. D. WEBB COMPANY	WEBB 99
Rheometer (Tack test)	Thermo Scientific	Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system	FEMTO	CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP	Hytest Ltd., Finland	4C28	(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI	Hytest Ltd., Finland	4T21	(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP	Abcam plc., MA	ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI	Abcam plc., MA	ab24460	(clone # 16A11)
hsCRP	Abcam plc., MA	ab111647
cTnI	Fitzgerald, MA	30-AT43
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
PBS	Amresco Inc	E404
Blood collection tubes	BD vacutainer	367844	K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes
SuperSignal ELISA femto	Invitrogen	37074
Modular multilabel plate reader	Perkin Elmer	Envision 2104
Disc operating machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Photomultiplier tube (PMT)	Hamamatsu Photonics	H1189-210
AutoCAD	AutoDesk	Version 2012	Design software
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2013	3D Design software,
Edgecam	Vero software	version 2009.01.06928	Code generating software
DeskCNC	Carken Co.	version 2.0.2.18	CNC milling machine software