Totalmente dispositivo automático centrífugo microfluídicos para a detecção de proteínas Ultrasensitive de Sangue Total

Resumo

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Resumo

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO₂ nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO₂ NF mat; transfer-printing of TiO₂ NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

Introdução

Várias plataformas para o diagnóstico da doença foram desenvolvidos com base em materiais em nanoescala ^1,2 tais como nanofios, ³ nanopartículas, nanotubos de ^{4, 5} e nanofibras (NFS) ^6-8. Estes nanomateriais oferecem excelentes perspectivas na concepção de novas tecnologias para bioensaios altamente sensíveis devido às suas propriedades físico-químicas únicas. Por exemplo, nanofibras de óxido de zinco mesoporosa têm sido utilizados para a detecção sensível de femto-molar de biomarcadores de cancro da mama. ⁹ Recentemente, os nanomateriais à base de dióxido de titânio (TiO ₂₎ têm sido exploradas para aplicações bioanaliticas ¹⁰ considerando-se a sua estabilidade química, ¹¹ desnaturação de proteínas negligenciável , ¹² e biocompatibilidade. ¹³ Além disso, os grupos hidroxilo na superfície de _TiO2 facilitar a modificação química e a ligação covalente de biomoléculas. modelado ^14,15 TiO ₂ thin películas ¹⁶ ou ¹⁷ TiO ₂ nanotubos têm sido utilizados para aumentar a sensibilidade de detecção de uma proteína-alvo, aumentando a área de superfície; No entanto, o processo de fabricação é bastante complexo e requer um equipamento caro. Por outro lado, as FN electrospun estão a receber atenção devido à sua elevada área de superfície, bem como processo de fabrico simples e de baixo custo; ^18,19 ainda, a característica frágil ou solto da esteira electrospun TiO ₂ NF torna difícil de manusear e integrar com dispositivos microfluídicos. ^6,20 Portanto, os TiO ₂ esteiras NF raramente foram utilizados em aplicações bioanalíticos, particularmente aquelas que requerem condições de lavagem agressivos.

Neste estudo, para ultrapassar estas limitações, desenvolvemos uma nova tecnologia para a transferência do electrospun NF esteiras sobre a superfície de qualquer substrato alvo, utilizando uma camada de adesivo fina polidimetilsiloxano (PDMS). Furthermore, que demonstraram com sucesso a integração de electrospun TiO ₂ NF esteiras para um dispositivo de microfluidos centrífuga de policarbonato (PC). Usando este dispositivo, uma detecção sensível de alta, totalmente automatizada e integrada de proteína C-reactiva (CRP), bem como a troponina I cardíaca (TIc) foi alcançada em 30 min a partir de apenas 10 ul de sangue total. ²¹ Devido ao combinado vantagens das propriedades da FN e a plataforma de centrífuga, o ensaio apresentava uma vasta gama dinâmica de seis ordens de grandeza a partir de 1 pg / ml (~ 8 fm) a 100 ng / ml (~ 0,8 pM) com um limite de detecção inferior de 0,8 pg / ml (~ 6 fm) para PCR e uma faixa dinâmica de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) e 100 ng / ml (~ 4 nM) com um limite de detecção de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) para cTnI. Estes limites de detecção são ~ 300 e ~ 20 vezes mais baixa em comparação com os seus correspondentes resultados de ELISA convencionais. Esta técnica pode ser aplicada para a detecção de quaisquer proteínas alvo, com anticorpos apropriados. No geral, este co dispositivould contribuir grandemente para diagnóstico in-vitro e ensaios bioquímicos uma vez que pode detectar quantidades raros de proteínas-alvo com grande sensibilidade mesmo a partir de quantidades muito pequenas de amostras biológicas, por exemplo, 10 ml de sangue total. Embora apenas se demonstrou a detecção de proteína de soro utilizando ELISA no presente estudo, a tecnologia de transferência e integração de electrospun FN com dispositivos de microfluidos pode ser mais amplamente aplicado em outras reacções bioquímicas que requerem uma grande área de superfície para detecção de alta sensibilidade.

Protocolo

NOTA: O sangue foi coletado de indivíduos saudáveis ​​e foi recolhido em um tubo de coleta de sangue. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os voluntários.

1. Fabricação de TiO ₂ NF Mat

1. Preparação da solução precursora de ²²
   1. Dissolve-se 1,5 g de tetra-isopropóxido de titânio (TTIP) numa mistura de etanol (99,9%, 3 ml) e ácido acético glacial (3 ml) e misturar a solução à TA (25 ° C) durante 30 minutos num agitador magnético.
   2. Dissolve-se 11% em peso de polivinil-pirrolidona (PVP) em 3,64 g de etanol (99,9%) e agita-se a solução a 65 ° C durante 1 hora utilizando um agitador magnético da placa quente.
   3. Combinar e agita-se as duas soluções a 65 ° C durante 4 horas num agitador magnético da placa quente.
2. electrospinning
   1. Carregar a solução preparada para uma seringa ligada a uma agulha de aço inoxidável de 200 um Diame internater. Verter a solução directamente para a seringa após a remoção do êmbolo.
   2. Introduzir a solução constantemente a uma taxa de fluxo de 0,3 mL / h durante 10 min numa bolacha de Si (2 cm x 2 cm) colocado sobre um substrato ligado à terra a uma tensão CC elevada (15 kV). Durante o electrospinning, defina a distância entre a agulha e o substrato ligado à terra a 10 cm.
3. Calcinação do tapete NF
   1. Coloque a esteira NF num forno e aumentar a temperatura até 500 ° C com uma taxa de rampa de 3 ° C / min sob condições de alto vácuo (5 x 10 ^-5 torr).
   2. Manter a temperatura a 500 ° C durante 3 h. Arrefecer a temperatura das amostras para a TA (25 ° C) no forno.

2. Integração de TiO ₂ NF Mat em uma centrífuga Microfluidic Disc

1. A fabricação de um disco
   1. Use o software design 3D (por exemplo, SolidWorks ou semelhante) para descrever câmaras, canais, ou válvulas de cada camada de disco. Converter os arquivos de design para código de computador controle numérico (CNC), utilizando software de código geração (por exemplo, Edgecam ou similar). Use os softwares de acordo com o manual de instruções ^23,24. Nota: As dimensões do canal típicos usados ​​neste aparelho são 1,0 mm x 0,3 mm (largura x profundidade).
   2. Abra o software operacional de fresadora CNC (ex., DeskCNC ou similar) e carregar código CNC para o software operacional e clique na seguinte em ordem: "AUTO" -> "G CÓDIGO ABERTO" -> Selecione o código CNC gerado.
   3. Fixar a placa de PC na máquina de fresagem CNC: use 1 placas mm PC para a camada superior e placas de PC 5 mm para a camada de disco. Execute o fresadora CNC para cortar cada camada do disco clicando no botão "Iniciar".
2. Transferência de TiO ₂ esteira NF no disco
   1. Coloque um substrato de silício e uma pequena placa de petri contendo 40 mL de (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triclorossilano numa câmara de vácuo sob vácuo durante 30 min. O fluorosilane vaporiza e é revestida sobre o substrato.
   2. Mistura de polidimetilsiloxano (PDMS) pré-polímero com um agente de cura numa proporção de 10: 1 e desgaseificar, em uma câmara de vácuo. Spin-revestimento PDMS num substrato de silício a 650 rpm durante 60 seg.
   3. Curar o PDMS revestido sobre substratos de silício num forno a 65 ° C durante 10 min para atingir um estado aderente.
      NOTA: tempo de cura pode variar dependendo das condições ambientais, e uma força de adesão pode ser testada por um teste de aderência utilizando um reómetro.
   4. Transferir a esteira de TiO ₂ NF preparado por electrospinning a calcinação e para o silício PDMS-revestidos usando uma pinça. Em seguida, aplicar manualmente uma pressão conformada na TiO ₂ mat NF transferida com um objecto plano (por exemplo., Lâmina de vidro) e remover o objeto. Colocaresta amostra no forno a 65 ° C durante 4 horas ou a 80 ° C durante 1 hora para curar a camada de PDMS completamente.
   5. O revestimento câmaras de reacção de ligação do disco com 20 ul do PDMS / mistura de agente de cura (10: 1), que actua como uma camada adesiva para prender o TiO ₂ esteira NF no disco.
   6. Pipetar 50 ul de etanol (99,9%) sobre a esteira de TiO ₂ NF sobre a camada de PDMS, cortar o tapete NF com um furador de diâmetro de 6 mm, e transferir o corte de TiO ₂ NF esteira para as câmaras de reacção de ligação revestidas com 20 ul de o PDMS no passo anterior.
      NOTA: Nesta etapa, o etanol será útil para separar o tapete de corte TiO ₂ NF a partir do substrato de Si.
   7. Incubar o TiO ₂ esteira NF disco integrada no forno a 65 ° C durante 4 horas ou a 80 ° C durante 1 hora para curar completamente o PDMS.
3. A modificação da superfície do tapete de TiO ₂ NF no disco
   1. Prepare 1% v / v de solução de (3-glicidoxipropil) silano methyldiethoxy (GPDES) em etanol (99,9%).
   2. Trate o disco integrada TiO ₂ mat NF com plasma de oxigênio a 140 W, fluxo de oxigênio de 50 sccm para 180 seg. Pipetar 100 l de solução GPDES em cada esteira de nanofibras e incubar à TA (25 ° C) durante 2 horas.
   3. Lave a substratos brevemente dispensando etanol (99,9%), utilizando um frasco de lavagem, em seguida, remover o etanol completamente invertendo o disco e apagando-o contra uma limpeza wipe. Cura a 80 ° C durante 1 h. Lavar duas vezes com etanol (99,9%) do mesmo modo como indicado acima, para remover as moléculas GPDES fisicamente adsorvida e não ligados.
   4. Secagem com uma corrente de azoto, seco sob vácuo.
      NOTA: O disco pode ser armazenado num contentor selado à TA (25 ° C) até à utilização.
4. A imobilização de anticorpos sobre a superfície
   1. Adicione uma solução de 200 ug / ml de anticorpos de captura (anticorpo monoclonal de ratinho antiO hsCRP humano ou monoclonal de ratinho anti-TIc) diluindo os anticorpos com um tampão de fosfato salino tamponado (PBS) (pH 7,4). Pipetar 5 ul da solução em cada esteira NF num disco utilizando uma micropipeta. Veja a lista de materiais para mais informações sobre os anticorpos.
   2. Manter os discos numa câmara humidif içada e incubar a 37 ° C durante 4 h. Lavar os anticorpos revestidos NF esteira com 0,1% de tampão de BSA-PBS. Encher a câmara com 100 ul de tampão de lavagem, utilizando uma micropipeta, remover o tampão por aspiração ou decantação. Finalmente, inverter o disco e apagá-lo contra um limpa limpe, e em seguida, montar o disco.
5. conjunto de disco
   1. Desenhar a concepção do disco na fita adesiva de lado duplo utilizando um programa de CAD (por exemplo, AutoCAD ou semelhante). Coloque o desenho CAD para o plotter de corte.
   2. Cortar a fita adesiva dupla-face usando o plotter de corte. Descolar uma camada de proteção de fita adesiva dupla e anexar iT na parte superior da camada do disco. Retire a outra camada de proteção e anexar a camada superior na camada de disco.
   3. Coloque o disco preliminarmente montado na máquina de prensagem e alinhar precisamente camadas superior / adesivo / disco utilizando marcas de alinhamento em cada camada para conectar cada válvula, canal e câmaras. Aplique pressão conformada de usar a máquina de prensagem.

3. Imunoensaio

1. Encha as câmaras com 1% BSA-PBS utilizando uma micropipeta e a incubação do disco de a 37 ° C durante 1 h. Remover o tampão por aspiração usando uma micropipeta. Executar esta etapa para bloquear os locais de reaco na ONU e para reduzir a adsorção não específica da proteína em um disco.
2. Lavar duas vezes com 0,1% de BSA-PBS através de enchimento e as câmaras de aspiração utilizando uma micropipeta.
   NOTA: Nesta fase, o disco pode ser armazenado a 4 ° C até à sua utilização.
3. Carga de 10 mL de sangue total cravado-antigénio ou soro livre de PCR para a detecção de CRP no disco usando um micropipette. Para fazer as curvas de calibração, usar concentrações de PCR a partir de 1 pg / ml a 100 ng / ml; e TIc a partir de 10 pg / ml a 100 ng / ml.
   NOTA: Devido aos níveis mais elevados de PCR no sangue total, que é geralmente na gama uM, soro livre de PCR foi utilizado para demonstrar o limite inferior de detecção do dispositivo.
4. Girar o disco a 3.600 rpm (391 xg) durante 60 segundos para separar as células vermelhas do sangue.
5. Abrir a válvula de # 1 a irradiação por laser, e a transferência de 4 ul do sobrenadante de plasma para a câmara que contém 8 ul de detecção de anticorpos conjugados com HRP pelo girar o disco a 2.400 rpm durante 3 seg.
   NOTA:. Os processos gerais para a actuação da válvula e visualização de utilização de discos estão descritos em detalhe em um relatório anterior ²¹
6. Aplicar um modo de mistura (15 Hz s ^-1, 15 ° C) durante 5 seg para a ligação dos anticorpos de proteína e detecção.
7. Abrir a válvula # 2, e transferir a mistura preparada no passo 6 para a câmara de reacção de ligação (2400 rpm, Três segundos). Em seguida, aplicar um modo de mistura (60 Hz s ^-1, 2 ° C) durante 20 min para conseguir uma imunorreacção entre a mistura e a anticorpos que se ligam sobre os TiO ₂ FN. Após a reacção, a válvula aberta # 3 e transferir a mistura residual para a câmara de resíduo (2.400 rpm, 10 segundos).
8. Transferir o tampão de lavagem (600 ul) para a câmara de reacção de ligação através da abertura de válvula de saída 4 e girando o disco (2400 rpm, 4 segundos). Em seguida, aplicar um modo de mistura (30 Hz s ^-1, 30 °), durante 120 segundos para lavar os _TiO2 NFs na câmara.
9. Lave as TiO ₂ FN mais duas vezes, seguindo mesma condição do passo 3.8, e remova o tampão de lavagem residual completamente girando o disco a 2.400 rpm por 20 s. Em seguida, fechar a válvula # 5.
10. Para a reacção quimioluminescente, aplicar um modo de mistura (30 Hz s ^-1, 2 ° C) durante 1 minuto após a transferência da solução de substrato quimioluminescente para a câmara de reacção de ligação através da abertura de válvula # 6 e fiaçãoo disco a 2.400 rpm durante 10 segundos, subsequentemente.
11. Transferir a solução de substrato reagido para as câmaras de detecção através da abertura da válvula 7 e girar o disco a 2.400 rpm durante 10 seg.
12. Medir os sinais de quimioluminescência da solução de substrato reagido utilizando um tubo fotomultiplicador (PMT) módulo de sistema de detecção equipada.
    NOTA: O sistema de detecção é uma máquina de costume construído utilizando os seguintes componentes: motor de etapa, componentes optomechanical, estágios de tradução e PMT disponível no mercado. As partes e optomechanical motor passo a passo são montados para conter o dispositivo, e o motor pode girar o disco. A detecção é realizada por PMT fixos nas partes optomechanical, e que está localizada acima das câmaras de detecção do dispositivo. Ao manipular o motor de passo, as câmaras de detecção estão alinhadas logo abaixo da zona de detecção de PMT.

Resultados

Usando este protocolo, um dispositivo de microfluidos centrífuga totalmente automatizado para a detecção de proteína a partir de sangue inteiro com elevada sensibilidade foi preparado. As esteiras de TiO ₂ NF foram preparados por processos de electrospinning e calcinação. A fim de fabricar o diâmetro desejado de FN, morfologia, e sua espessura, electrospinning condições tais como a taxa de fluxo, tensão, e o tempo de fiação foram optimizados. Quando as condições ...

Discussão

O ensaio em TiO ₂ NF disco integrada é uma técnica rápida, barata e conveniente para a detecção ultra-sensível de baixas proteínas abundantes presentes em muito baixo volume de sangue. Esta técnica tem a vantagem da utilização de pequenos volumes de amostra (10 ul) e é receptivo para a análise de múltiplas amostras em simultâneo. Isto proporciona um grande potencial como um dispositivo de multiplexação de imunoensaio. O dispositivo tem a vantagem adicional de que ele não requer passos de pré...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	LG SILTRON	Polished Wafer, test grade	Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)	Daedong Plastic	PCS#6900	Thickness (mm) = 1 and 5
Titanium tetraisopropoxide, 98%,	Sigma-Aldrich	205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000	Sigma-Aldrich	437190
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Anhydrous ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS and curing agent	Dow Corning	SYLGARD 184
GPDES	Gelest Inc	SIG5832.0
Ethanol	J T Baker
FE-SEM	FEI	Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy	ThermoFisher	K-alpha
3D modeling machine	M&I CNC Lab, Korea		CNC milling machine
Wax-dispensing machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Double-sided adhesive tape	FLEXcon, USA	DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter	Graphtec Corporation, Japan	Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater	MIDAS	SPIN-3000D
Furnace (calcination)	R. D. WEBB COMPANY	WEBB 99
Rheometer (Tack test)	Thermo Scientific	Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system	FEMTO	CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP	Hytest Ltd., Finland	4C28	(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI	Hytest Ltd., Finland	4T21	(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP	Abcam plc., MA	ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI	Abcam plc., MA	ab24460	(clone # 16A11)
hsCRP	Abcam plc., MA	ab111647
cTnI	Fitzgerald, MA	30-AT43
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
PBS	Amresco Inc	E404
Blood collection tubes	BD vacutainer	367844	K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes
SuperSignal ELISA femto	Invitrogen	37074
Modular multilabel plate reader	Perkin Elmer	Envision 2104
Disc operating machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Photomultiplier tube (PMT)	Hamamatsu Photonics	H1189-210
AutoCAD	AutoDesk	Version 2012	Design software
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2013	3D Design software,
Edgecam	Vero software	version 2009.01.06928	Code generating software
DeskCNC	Carken Co.	version 2.0.2.18	CNC milling machine software