전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치

요약

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

초록

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO₂ nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO₂ NF mat; transfer-printing of TiO₂ NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

서문

질병 진단을위한 여러 플랫폼 ^1,2- 예컨대 나노 와이어, 나노 입자 ^{(3), (4)} 나노 튜브 ^(5)와 나노 파이버 (NFS) ^6-8과 같은 나노 재료에 기초하여 개발되었다. 이 나노 물질은 독특한 물리 화학적 특성으로 인해 매우 민감한 생물 검정을위한 새로운 기술의 디자인 적으로도 뛰어난 전망을 제공합니다. 예를 들어, 메조 포러스 산화 아연 나노 유방암 바이오 마커의 펨토 몰 민감한 검출을 위해 사용되었다. ^구 최근 화학적 안정성을 고려하여 생체 시료 애플리케이션 ¹⁰ 탐구되었다 티탄 _(TiO2), 이산화에 기초하여 나노 물질을 ¹¹ 무시할 단백질 변성 ¹² 및 또한 생체 ^{적합성.도 13은} _이산화 티탄의 표면에 수산기 화학적 변형 및 생체 분자의 공유 결합을 용이하게한다. ^14,15 무늬 _이산화 티탄 생N 막 ¹⁶ _이산화 티탄 _⁽¹⁷⁾ 표면적이 증가하여 표적 단백질의 검출 감도를 향상시키는 데에 이용 된 나노 튜브; 그러나, 제조 공정이 다소 복잡하고 값 비싼 장비를 필요로한다. 한편, 전기 방사 NFS가 간단하고 저렴한 제조 공정뿐만 아니라 그들의 높은 표면적 주목 받고; ^{18,19 아직} 상기 전기 방사 _이산화 티탄 NF 매트 취약한 느슨한 특성 다루기가 어렵고 미세 유체 장치와 통합 할 수 있습니다. ^6,20을 따라서, _이산화 티탄 NF 매트는 거의, 생체 시료 응용 프로그램에서 거친 세척 조건을 필요로 특히 활용되지 않았다.

본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 얇은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 접착제 층을 이용하여 임의의 피 처리 기판의 표면에 매트 NF는 전기 방사를 전송하는 새로운 기술을 개발 하였다. 작고에hermore, 우리는 성공적으로 폴리 카보네이트 (PC)로 이루어진 원심 미세 유체 소자로 전기 방사 티오 NF는 매트 _(2)의 적분을 보여왔다. 이 장치를 사용하여, C 반응성 단백질의 민감한 높은 완전 자동화 된, 통합 검색 (CRP)뿐만 아니라 심장 트로포 닌 I (cTnI는)는 전체 혈액의 10 μL에서 30 분 이내에 달성 하였다. ^(21)로 인해 결합에 는 NFS와 원심 플랫폼의 특성의 장점은 분석은 검출 하한 100 ng를 / ㎖ (0.8 ~ PM) 1 pg / ml 인 (~ 8 FM)에서 크기의 여섯 주문의 넓은 동적 범위를 전시 CRP (37) PG / ㎖ (~ 오후 1시 5분)의 검출 한계 100ng의 / ㎖ (~ 4 ㎚) 10 pg / ml 인 (0.4 ~ PM)의 동적 범위의 0.8 pg / ml이다 (~ 6 FM)의 cTnI는합니다. 이러한 검출 한계는 300 ~되고, 20 배, 대응하는 종래의 ELISA 결과와 비교하여 낮은. 이 기술은 적절한 항체 모든 표적 단백질의 검출에 적용될 수있다. 전반적으로,이 장치 공동예를 들면, 전혈을 10 μl를 그것은 생물학적 샘플의 극소량에서조차 좋은 감도로 표적 단백질의 드문 양을 검출 할 수 있기 때문에 ULD은 체외 진단 및 생화학 적 분석에 크게 기여한다. 우리는이 연구에서 ELISA를 사용하여 혈청 단백질 검출을 증명하지만, 미세 유체 소자와 전기 방사의 NFS 전사 통합 기술은 더 광범위하게 높은 검출 감도를위한 큰 표면적을 필요로하는 다른 생화학 적 반응에 적용될 수있다.

프로토콜

주 : 혈액 건강한 사람에서 도출하고, 혈액 수집 튜브에 수집 하였다. 서면 동의서는 모든 자원 봉사자들로부터 얻은 것입니다.

_이산화 티탄 NF 매트 1. 제작

1. 전구체 용액 ^(22)의 제조
   1. 에탄올 (99.9 %, 3 ml) 및 빙초산 (3 mL)을 혼합하여 티타늄 테트라 이소 프로 폭 사이드 (TTIP) 1.5 g을 용해시키고, 자기 교반기에서 30 분 동안 RT에서의 수용액 (25 ° C)을 혼합한다.
   2. 에탄올 (99.9 %)의 3.64 g의 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP)의 11 중량 %를 용해시키고, 핫 플레이트, 자기 교반기를 사용하여 1 시간 동안 65 ° C에서 상기 용액을 교반한다.
   3. 결합 및 핫 플레이트 자석 교반기 4 시간 동안 65 ° C에서 두 솔루션을 저어.
2. 전기 방사
   1. 200 μm의 내측 diame의 스테인리스 바늘에 연결된 주사기로 제조 된 용액을로드터. 플런저를 제거한 후, 주사기에 직접 용액을 붓는다.
   2. 높은 DC 전압 (15 kV로)에 접지 된 기판 상에 배치 된 실리콘 웨이퍼 상에 10 분 동안 0.3 ml / hr의 유량 (2cm X 2cm)에 항상 용액을 소개한다. 전기 방사 중에 니들 10cm에 접지 기판 사이의 거리를 설정한다.
3. NF 개의 매트의 하소
   1. 노에서 NF 매트를 놓고 고진공 조건 (5 × ^10-5 토르)하에 3 ℃ / 분으로 램핑 속도로 500 ℃까지 온도를 증가시킨다.
   2. 3 시간 동안 500 ° C의 온도를 유지한다. 노의 RT (25 °의 C)로 샘플의 온도를 냉각.

원심 미세 유체 디스크에 티오 2. _통합이 NF 매트

1. 디스크의 제조
   1. 3 차원 설계 소프트웨어 (예를 들면, 솔을 사용하여idWorks 또는) 유사한 디스크의 각 층의 챔버, 채널 또는 밸브를 묘사한다. 코드 생성 소프트웨어 (예를 들어, Edgecam 또는 유사)를 사용하여 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 코드 설계 파일을 변환합니다. 상기 명령에 따라 소프트웨어를 사용 설명서 ^23,24 참고.이 장치에 사용되는 일반적인 채널 치수 X 0.3 mm (폭 X 깊이) 1.0 mm이다.
   2. (CNC 밀링 머신의 운영 소프트웨어를 열고 예., DeskCNC 또는 이와 유사한 것) 및 운영 소프트웨어 CNC 코드를로드하고 순서대로 다음을 클릭합니다 : "AUTO"-> "G CODE OPEN을"-> 생성 된 CNC 코드를 선택합니다.
   3. CNC에 밀링 머신의 PC 판을 부착 : 디스크 층에 대한 상위 계층과 5mm의 PC 판을위한 1mm의 PC 판을 사용합니다. "시작"버튼을 클릭하여 디스크의 각 층을 절단하는 CNC 밀링 머신을 실행합니다.
2. 디스크 상에 _이산화 티탄 NF 매트의 전송
   1. 실리콘 기판 40 μL (트리 데카 -1,1,2,2- tetrahydrooctyl)에서 30 분 동안 진공 하에서 진공 챔버 -1- 트리클로로 실란을 함유하는 작은 페트리 접시를 놓는다. 플루오로 실란이 증발하여 기판에 도포 얻는다.
   2. 진공 챔버에서 탈기 한 비율 10 : 경화제로 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 예비 중합체를 혼합한다. 스핀 코트를 60 초 동안 650 rpm으로 실리콘 기판 상에 PDMS.
   3. 10 분 점착성 상태를 달성하기 위해 65 ° C의 오븐에서 실리콘 기판 상에 코팅 된 PDMS 큐어.
      주 : 경화 시간은 환경 조건에 따라 변화 될 수 있고, 접착력은 레오 미터를 사용하여 점착성 시험에 의해 시험 될 수있다.
   4. 트위터를 사용하여 PDMS 코팅 된 실리콘에 전기 방사 및 소성에 의해 제조 된 _이산화 티탄 NF 매트를 전송합니다. 그런 다음, 수동 (유리 슬라이드, 예.) 평면 객체에 전송 된 _이산화 티탄 NF 매트에 균일 한 압력을 적용하고 개체를 제거합니다. 놓다4 시간 동안 65 ℃에서 또는 1 시간 동안 80 ° C의 오븐에서 샘플이 완전히 PDMS 층을 경화한다.
   5. 20 μL를 PDMS / 경화제 혼합물과 디스크에 코트 결합 반응 챔버 (10 : 1), 접착제 층 역할을하는 디스크에 _이산화 티탄 NF 매트를 부착합니다.
   6. PDMS의 층에 _이산화 티탄 NF 매트에 에탄올 (99.9 %)의 50 μL를 분배 6 mm 직경의 펀치 구멍과 NF 매트를 절단하고, 20 μL로 코팅 된 결합 반응 챔버 _이산화 티탄 NF 매트를 절단 전송 이전 단계에서 PDMS의.
      참고 :이 단계에서, 에탄올 Si 기판에서 절단 _이산화 티탄 NF 매트를 분리하는 데 도움이 될 것입니다.
   7. 1 시간 완전 경화 PDMS를 4 시간 동안 80 ° C에서 65 ° C의 오븐에서 _이산화 티탄 NF 매트 내장형 디스크 부화.
3. 디스크상의 _이산화 티탄 NF 매트의 표면 개질
   1. 피에탄올 (3- 글리시 독시) methyldiethoxy 실란 (GPDES)의 repare 1 % v / V를 용액 (99.9 %).
   2. 140 W, 180 초 동안 50 sccm의 산소 흐름에 산소 플라즈마와 _이산화 티탄 NF 매트 통합 된 디스크를 취급합니다. 각각의 나노 섬유 매트에 GPDES 용액 100 μl를 분배하고 2 시간 동안 RT (25 °에 C)에 품어.
   3. 세척 병을 사용하여 에탄올 (99.9 %)을 분배하여 기판 간단히 세척 한 후 디스크를 반전하고 깨끗한 대해 그것을 닦아 블로 팅에 의해 완전히 에탄올을 제거합니다. 1 시간 동안 80 ℃에서 경화. 상술 한 바와 같이 물리적으로 흡착 바운드 GPDES 분자를 제거하고, 동일한 방식으로 에탄올 (99.9 %)로 두 번 세척 하였다.
   4. 건식 진공 상태에서, 질소 기류로 바람을 불어 건조.
      주 : 디스크를 사용할 때까지 실온 (25 ℃)에서 밀폐 용기에 저장 될 수있다.
4. 표면에 항체의 고정화
   1. 포획 항체 200 μg의 / ㎖의 용액 (마우스 모노클로 날 항 만들기인간 hsCRP 또는 인산염 완충 식염수 (PBS) 완충액 (pH 7.4)로 항체를 희석하여 단일 클론 마우스 항 cTnI는). 마이크로 피펫을 사용하여 디스크의 각 NF 매트 상 용액 5 μL를 분배. 항체에 대한 자세한 내용은 자료의 목록을 참조하십시오.
   2. 가습 실에서 디스크를 유지하고 4 시간 동안 37 ° C에서 품어. 0.1 % BSA-PBS 버퍼와 NF 매트 코팅 된 항체를 씻으십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 세척 완충액 100 ㎕와 챔버를 채우기, 흡입 또는 경사에 의해 버퍼를 제거합니다. 마지막으로, 디스크를 반전하고 깨끗한 닦아에 대해 그것을 가릴 다음 디스크를 조립한다.
5. 디스크 어셈블리
   1. 캐드 프로그램 (예 AutoCAD의 또는 유사한)를 사용하여 양면 접착 테이프, 디스크의 디자인을 그린다. 커팅 플로터에 CAD 설계를 넣습니다.
   2. 커팅 플로터를 사용하여 양면 접착 테이프를 잘라. 이중 접착 테이프의 한 보호 층을 벗겨과 내가 첨부디스크 층의 상단에 t. 다른 보호 층을 벗겨 디스크 상에 상부 층을 연결합니다.
   3. 프레스 기계에 미리 조립 된 디스크를로드하고 정확하게 각 밸브, 채널 및 챔버를 연결하는 각 층에 정렬 마크를 사용하여 상단 / 접착제 / 디스크 층을 맞 춥니 다. 프레스 기계를 사용하여 균일 한 압력을 적용합니다.

3. 면역

1. 마이크로 피펫을 이용하여 1 % BSA-PBS 완충액 챔버를 채우고, 1 시간 동안 37 ° C에서 디스크를 배양한다. 마이크로 피펫을 사용하여 흡인하여 버퍼를 제거합니다. 미 반응 사이트를 차단하고, 디스크에 단백질의 비특이적 흡착을 감소시키기 위해이 단계를 수행한다.
2. 충전 및 마이크로 피펫을 사용하여 실을 흡입하여 0.1 % BSA-PBS로 두 번 세척 하였다.
   참고 :이 단계에서 디스크를 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. micropipett을 사용하여 디스크에 CRP 검출을위한 항원 아군 전체 혈액 또는 CRP 무 혈청로드 10 μL이자형. 교정 그래프를 만들기 위해, 100ng의 / ㎖ 1 pg / ml이다에서 CRP 농도를 사용한다; cTnI는 10 pg / ml 인 내지 100 ng / ml이되게 준비 하였다.
   참고 μM의 범위이다 전혈에서 CRP의 높은 수준으로 인해 CRP 무 혈청 장치의 낮은 검출 한계를 보여주기 위해 사용되었다.
4. 적혈구를 분리하는 60 초 동안 3600 RPM (XG 391)에서 디스크를 스핀.
5. 개방 밸브 레이저 조사에 의해 1 번, 그리고 전사 3 초 동안 2400 rpm으로 디스크를 회전시켜 HRP가 결합 된 항체를 검출 8 μL를 포함하는 챔버에 뜨는 플라즈마 4 μL.
   주 :. 밸브 활성화 및 디스크 동작의 시각화를위한 일반적인 프로세스는 이전의 보고서에 상세히 설명 ²¹
6. 단백질 검출 항체의 결합을 5 초 동안 혼합 모드 (15 Hz에서의 ^-1, 15 °)를 적용합니다.
7. 오픈 밸브 # 2, 결합 반응 챔버 6 단계에서 제조 된 혼합물을 트랜스퍼 (2,400 RPM3 초). 이어서, 혼합물을 _이산화 티탄 연맹에 결합하는 항체 사이의 면역 반응을 달성하기 위해 20 분 동안 혼합 모드 (60 Hz에서의 ^-1,2- °)을 적용한다. 상기 반응 개방 밸브 # 3 후 폐 챔버 (2400 RPM, 10 초)에 잔류 혼합물을 옮긴다.
8. 밸브 # 4를 열고 디스크 (2400 rpm으로 4 초)을 회전시켜 결합 반응 챔버의 세정 완충액 (600 μL)를 옮긴다. 이어서 챔버 내의 _이산화 티탄 연맹 씻어 120 초 동안 혼합 모드 (30 Hz에서의 ^-1, 30 °)를 적용한다.
9. 단계 3.8의 동일한 조건에 따라 두 번 더 _이산화 티탄 연맹을 세척하고, 20 초 동안 2,400 rpm에서 디스크를 회전시켜 완전히 잔류 세척 버퍼를 제거합니다. 그리고, 밸브 # 5를 닫는다.
10. 화학 발광 반응을위한 밸브 # 6 및 방사를 개방함으로써 결합 반응 챔버에 화학 발광 기질 용액을 전송 한 후 1 분 동안 혼합 모드 (30 Hz에서의 ^-1,2- °)를 적용이후 10 초 동안 2,400 rpm에서 디스크.
11. 밸브를 개방 # 7, 10 초 동안 2400 rpm으로 디스크를 회전시켜 상기 검출 챔버로 반응 기질 용액을 전송.
12. 광전자 증 배관 (PMT) 모듈을 갖춘 검출 시스템을 사용하여 반응 기질 용액에서 화학 발광 신호를 측정한다.
    주 : 스텝 모터, 현미경 성분 변환 단계, 및 상업적으로 입수 한 PMT : 검출 계는 다음과 같은 부품을 사용하여 맞춤형 기계이다. 현미경 부품, 스텝 모터 장치를 유지하도록 조립되고, 모터는 디스크를 회전시킬 수있다. 검출은 현미경 부에 고정 된 PMT에 의해 수행되고, 이는 상기 장치의 검출 챔버 위에 배치된다. 스텝 모터를 조작함으로써, 검출 챔버 바로 PMT의 검출 영역 아래에 정렬된다.

결과

이 프로토콜, 높은 감도를 제조 하였다으로 전체 혈액에서 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치를 사용. _이산화 티탄 NF 매트는 전기 방사 및 소성 공정에 의해 제조 하였다. 이러한 유량, 전압 및 회전 시간 등의 조건을 전기 방사 원하는 직경, 형태 및 두께는 NFS를 제조하기 위해 최적화되었다. 조건이 최적화되지 않은 경우는 NFS 형성의 질이 저...

토론

_이산화 티탄 NF 통합 된 디스크에 대한 분석은 혈액의 매우 낮은 볼륨에 존재하는 낮은 풍부한 단백질의 고감도 검출을위한 신속하고 저렴하고 편리한 기술이다. 이 기술은 적은 양의 샘플 (10 μL)를 사용하는 장점을 가지며, 동시에 다수의 샘플 분석을위한 의무이다. 이것은 다중 면역 장치로서 큰 잠재력을 제공한다. 상기 장치는 통상적 인 ELISA를에 필요한 혈장 분리, 같은 시료의 전처리...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	LG SILTRON	Polished Wafer, test grade	Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)	Daedong Plastic	PCS#6900	Thickness (mm) = 1 and 5
Titanium tetraisopropoxide, 98%,	Sigma-Aldrich	205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000	Sigma-Aldrich	437190
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Anhydrous ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS and curing agent	Dow Corning	SYLGARD 184
GPDES	Gelest Inc	SIG5832.0
Ethanol	J T Baker
FE-SEM	FEI	Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy	ThermoFisher	K-alpha
3D modeling machine	M&I CNC Lab, Korea		CNC milling machine
Wax-dispensing machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Double-sided adhesive tape	FLEXcon, USA	DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter	Graphtec Corporation, Japan	Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater	MIDAS	SPIN-3000D
Furnace (calcination)	R. D. WEBB COMPANY	WEBB 99
Rheometer (Tack test)	Thermo Scientific	Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system	FEMTO	CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP	Hytest Ltd., Finland	4C28	(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI	Hytest Ltd., Finland	4T21	(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP	Abcam plc., MA	ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI	Abcam plc., MA	ab24460	(clone # 16A11)
hsCRP	Abcam plc., MA	ab111647
cTnI	Fitzgerald, MA	30-AT43
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
PBS	Amresco Inc	E404
Blood collection tubes	BD vacutainer	367844	K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes
SuperSignal ELISA femto	Invitrogen	37074
Modular multilabel plate reader	Perkin Elmer	Envision 2104
Disc operating machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Photomultiplier tube (PMT)	Hamamatsu Photonics	H1189-210
AutoCAD	AutoDesk	Version 2012	Design software
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2013	3D Design software,
Edgecam	Vero software	version 2009.01.06928	Code generating software
DeskCNC	Carken Co.	version 2.0.2.18	CNC milling machine software