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Resumen

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Resumen

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

Introducción

Varias plataformas para el diagnóstico de la enfermedad se han desarrollado sobre la base de materiales a nanoescala 1,2 tales como nanocables, 3 nanopartículas, nanotubos de 4, 5 y nanofibras (NFS) 6-8. Estos nanomateriales ofrecen excelentes perspectivas en el diseño de nuevas tecnologías para bioensayos altamente sensibles debido a sus propiedades físico-químicas únicas. Por ejemplo, las nanofibras de óxido de zinc mesoporoso se han utilizado para la detección sensible femto-molar de biomarcadores de cáncer de mama. 9 Recientemente, los nanomateriales a base de dióxido de titanio (TiO 2) han sido exploradas para aplicaciones bioanalíticos 10 teniendo en cuenta su estabilidad química, 11 desnaturalización de la proteína insignificante , 12 y biocompatibilidad. 13 Además, los grupos hidroxilo en la superficie de TiO 2 facilitar la modificación química y la unión covalente de biomoléculas. 14,15 modelado TiO 2 thin películas 16 o TiO 2 nanotubos 17 se han utilizado para mejorar la sensibilidad de detección de una proteína diana por aumento de la superficie; sin embargo, el proceso de fabricación es bastante complejo y requiere un equipo caro. Por otra parte, las federaciones nacionales electrospun están recibiendo atención debido a su gran área de superficie, así como proceso sencillo y fabricación de bajo costo; 18,19 sin embargo, la característica frágiles o suelto de la electrospun TiO2 NF tapete hace que sea difícil de manejar y integrar con los dispositivos de microfluidos. 6,20 por lo tanto, las esteras de TiO2 NF rara vez se utilizan en aplicaciones de bioanálisis, particularmente aquellos que requieren condiciones de lavado agresivos.

En este estudio, para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una nueva tecnología para la transferencia de la electrospun NF esteras sobre la superficie de cualquier sustrato diana mediante la utilización de una capa de adhesivo de polidimetilsiloxano delgada (PDMS). Furthermore, hemos demostrado con éxito la integración de electrospun TiO 2 NF esteras en un dispositivo de microfluidos centrífuga de policarbonato (PC). El uso de este dispositivo, una detección de alta sensibilidad, totalmente automatizado e integrado de la proteína C-reactiva (CRP), así como la troponina I cardíaca (cTnI) se logró en 30 min a partir de solamente 10 l de sangre entera. 21 Debido a la combinación ventajas de las propiedades de los NF y la plataforma centrífuga, el ensayo exhibieron una amplia gama dinámica de seis órdenes de magnitud de 1 pg / ml (~ 8 fM) a 100 ng / ml (~ 0,8 pM) con un límite inferior de detección de 0,8 pg / ml (~ 6 fM) para la PCR y un rango dinámico de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) a 100 ng / ml (~ 4 nM) con un límite de detección de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) de cTnI. Estos límites de detección son ~ 300 y ~ 20 veces menor en comparación con sus correspondientes resultados de ELISA convencionales. Esta técnica se podría aplicar para la detección de cualquier proteína objetivo, con los anticuerpos apropiados. En general, este dispositivo de coULD contribuyen en gran medida en el diagnóstico in vitro y ensayos bioquímicos ya que puede detectar cantidades raras de proteínas diana con gran sensibilidad incluso de cantidades muy pequeñas de muestras biológicas, por ejemplo, 10 l de sangre entera. A pesar de que sólo demostró la detección de proteínas de suero usando ELISA en este estudio, la tecnología de transferencia e integración de electrospun NFS con dispositivos de microfluidos podría aplicarse más ampliamente en otras reacciones bioquímicas que requieren una gran área superficial para la alta sensibilidad de detección.

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Protocolo

NOTA: Se extrajo sangre de individuos sanos y se recogió en un tubo de recogida de sangre. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los voluntarios.

1. La fabricación de TiO2 NF Mat

  1. Preparación de solución de precursor 22
    1. Disolver 1,5 g de tetraisopropóxido de titanio (TTIP) en una mezcla de etanol (99,9%, 3 ml) y ácido acético glacial (3 ml) y se mezcla la solución a temperatura ambiente (25 ° C) durante 30 min en un agitador magnético.
    2. Disolver 11% en peso de polivinilpirrolidona (PVP) en 3,64 g de etanol (99,9%) y se agita la solución a 65 ° C durante 1 hora usando un agitador magnético de la placa caliente.
    3. Combinar y agitar las dos soluciones a 65 ° C durante 4 horas en un agitador magnético de la placa caliente.
  2. electrospinning
    1. Cargar la solución preparada en una jeringa conectada a una aguja de acero inoxidable de 200 micras Diame interiorter. Verter la solución directamente en la jeringa después de retirar el émbolo.
    2. Introducir la solución constantemente a una velocidad de flujo de 0,3 ml / h durante 10 min sobre una oblea de Si (2 cm x 2 cm) se coloca sobre un sustrato conectado a tierra a un voltaje DC elevado (15 kV). Durante el electrospinning, ajustar la distancia entre la aguja y el sustrato de tierra a 10 cm.
  3. La calcinación de la estera de NF
    1. Coloca la base de NF en un horno y aumentar la temperatura hasta 500 ° C con una tasa de rampa de 3 ° C / min en condiciones de alto vacío (5 x 10 -5 torr).
    2. Mantener la temperatura a 500 ° C durante 3 hr. Enfriar la temperatura de las muestras a la RT (25 ° C) en el horno.

2. Integración de TiO2 NF Mat en una centrífuga de discos de microfluidos

  1. La fabricación de un disco
    1. Utilice el software de diseño 3D (por ejemplo, SolidWorks o similar) para representar cámaras, canales, o válvulas de cada capa de disco. Convertir los archivos de diseño a código informático de control numérico (CNC) utilizando el código de generación de software (por ejemplo, Edgecam o similar). Utilizar los softwares de acuerdo con el manual de instrucciones 23,24 Nota:. Las dimensiones de los canales típicos utilizados en este dispositivo son de 1,0 mm x 0,3 mm (anchura x profundidad).
    2. Abra el software de funcionamiento de la máquina fresadora CNC (por ejemplo., DeskCNC o similar) y cargar el código CNC para el software operativo y haga clic en el siguiente orden: "AUTO" -> "G CÓDIGO ABIERTO" -> Seleccione el código CNC generado.
    3. Fije la placa de PC en la máquina fresadora CNC: utilizar placas de 1 mm de PC para la capa superior y placas de PC 5 mm para la capa de disco. Hacer funcionar la máquina fresadora CNC para cortar cada capa del disco haciendo clic en el botón "START".
  2. Transferencia de TiO 2 NF estera en el disco
    1. Colocar un sustrato de silicio y una pequeña placa de Petri que contiene 40 l de (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triclorosilano en una cámara de vacío bajo vacío durante 30 min. El fluorosilano se vaporiza y se reviste sobre el sustrato.
    2. Mezclar polidimetilsiloxano (PDMS) pre-polímero con un agente de curado en una relación de 10: 1 y desgasificar en una cámara de vacío. Spin-capa de PDMS sobre un sustrato de silicio a 650 rpm durante 60 segundos.
    3. Curar los PDMS revestidas sobre el sustrato de silicio en un horno a 65 ° C durante 10 min para lograr un estado adherente.
      NOTA: Tiempo de curado se puede variar dependiendo de las condiciones ambientales, y la fuerza de adhesión puede ser probada mediante un ensayo de pegajosidad utilizando un reómetro.
    4. La transferencia de la estera de TiO2 NF preparado por electrospinning y calcinación en la silicona PDMS-revestidas utilizando una pinza. A continuación, aplicar manualmente una presión conforme en el TiO2 NF estera transferido con un objeto plano (por ejemplo., Portaobjetos de vidrio) y extraer el objeto. Poneresta muestra en el horno a 65 ° C durante 4 horas o a 80 ° C durante 1 hora para curar la capa de PDMS completamente.
    5. Escudo cámaras de reacción de unión en el disco con 20 l el / curado mezcla de agente de PDMS (10: 1), que actúa como una capa adhesiva para fijar TiO 2 NF estera en el disco.
    6. Dispensar 50 l de etanol (99,9%) sobre el TiO 2 NF estera en la capa de PDMS, cortar la estera de NF con una perforación de orificios de 6 mm de diámetro, y transferir el corte TiO 2 NF estera a las cámaras de reacción de unión recubiertas con 20 l de los PDMS en el paso anterior.
      NOTA: En este paso, el etanol será útil para separar el corte TiO2 NF estera del sustrato de Si.
    7. Incubar el TiO2 NF esterilla integrada en el disco en el horno a 65 ° C durante 4 horas o a 80 ° C durante 1 hora para curar el PDMS por completo.
  3. Modificación de la superficie del TiO2 NF estera en el disco
    1. Prepare 1% v / v de (3-glicidoxipropil) silano methyldiethoxy (GPDES) en etanol (99,9%).
    2. Se trata el disco integrada TiO2 NF estera con plasma de oxígeno a 140 W, el flujo de oxígeno de 50 sccm de 180 seg. Dispensar 100 l de solución de GPDES en cada estera de nanofibras y se incuba a RT (25 ° C) durante 2 hr.
    3. Lavar el sustrato brevemente por la dispensación de etanol (99,9%) usando una botella de lavado, a continuación, eliminar el etanol completamente invirtiendo el disco y secante contra una toallita limpia. De curado a 80 ° C durante 1 hr. Lavar dos veces con etanol (99,9%) de la misma manera como se indicó anteriormente, para eliminar las moléculas adsorbidas físicamente GPDES y no unidos.
    4. Secar con una corriente de nitrógeno, seca al vacío.
      NOTA: El disco puede ser almacenado en un recipiente sellado a temperatura ambiente (25 ° C) hasta su uso.
  4. Inmovilización de anticuerpos sobre la superficie
    1. Hacer una solución de 200 g / ml de anticuerpos de captura (anti ratón monoclonalhsCRP humano o de ratón monoclonal anti-cTnI) diluyendo los anticuerpos con un tampón de fosfato salino tamponado (PBS) (pH 7,4). Dispensar 5 l de la solución sobre cada estera de NF en un disco utilizando una micropipeta. Ver la lista de materiales para obtener más información acerca de los anticuerpos.
    2. Mantener los discos en una cámara humidificada y se incuba a 37 ° C durante 4 h. Lavar los anticuerpos recubiertos NF estera con tampón PBS-BSA al 0,1%. Llenar la cámara con 100 l de tampón de lavado utilizando una micropipeta, eliminar el tampón por aspiración o decantación. Por último, invertir el disco y borrar contra un trapo limpio, y luego montar el disco.
  5. conjunto de discos
    1. Dibujar el diseño del disco en la cinta adhesiva de doble lado con un programa de CAD (por ejemplo, AutoCAD o similar). Cargar el diseño CAD para el plotter de corte.
    2. Cortar la cinta adhesiva de doble cara utilizando el plotter de corte. Pelar una capa de protección de la cinta adhesiva de doble y adjuntar it en la parte superior de la capa de disco. Despegar la otra capa de protección y unir la capa superior de la capa de disco.
    3. Cargar el disco montado de forma preliminar en la máquina de prensado y alinear con precisión las capas superior / adhesivo / disco utilizando las marcas de alineación en cada capa para conectar cada una de las válvulas, canales y cámaras. Aplique presión conforme el uso de la máquina de prensado.

3. Inmunoensayo

  1. Llenar las cámaras con tampón BSA-PBS al 1% utilizando una micropipeta y se incuba el disco a 37 ° C durante 1 hr. Eliminar el tampón por aspiración utilizando una micropipeta. Realice este paso para bloquear los sitios sin reaccionar y para reducir la adsorción no específica de la proteína en un disco.
  2. Lavar dos veces con 0,1% BSA-PBS por llenado y aspiración de las cámaras utilizando una micropipeta.
    NOTA: En esta etapa el disco se puede almacenar a 4 ° C hasta su uso.
  3. Carga de 10 l de sangre entera antígeno-enriquecida o suero libre de PCR para la detección de la PCR en el disco utilizando un micropipettmi. Para hacer los gráficos de calibración, utilizar concentraciones de CRP de 1 pg / ml a 100 ng / ml; y cTnI de 10 pg / ml a 100 ng / ml.
    Nota: debido a los mayores niveles de CRP en la sangre total, que es generalmente en el rango de M, se utilizó suero libre de CRP para demostrar el bajo límite de detección del dispositivo.
  4. Girar el disco a 3600 rpm (391 xg) durante 60 segundos para separar las células de sangre rojas.
  5. Abrir la válvula # 1 por la irradiación con láser, y la transferencia de 4 l de plasma sobrenadante a la cámara que contiene 8 l de la detección de anticuerpos conjugados con HRP haciendo girar el disco a 2400 rpm durante 3 seg.
    NOTA:. Los procesos generales de actuación de la válvula y la visualización de la operación de disco se describen en detalle en un informe anterior 21
  6. Aplicar un modo de mezcla (15 Hz s -1, 15 °) durante 5 segundos para la unión de los anticuerpos de proteínas y detección.
  7. Abrir la válvula # 2, y transferir la mezcla preparada en la etapa 6 a la cámara de reacción de unión (2400 rpm, 3 seg). A continuación, aplicar un modo de mezcla (60 Hz s -1, 2 °) durante 20 minutos para lograr una inmunoreacción entre la mezcla y los anticuerpos de unión en los TiO 2 NFS. Después de la reacción, la válvula abierta # 3 y transferir la mezcla residual a la cámara de residuos (2.400 rpm, 10 sec).
  8. Transferir el tampón de lavado (600 l) a la cámara de reacción de unión mediante la apertura de la válvula # 4 y hace girar el disco (2400 rpm, 4 segundos). A continuación, aplicar un modo de mezcla (30 Hz s-1, 30 °) durante 120 segundos para lavar las federaciones nacionales de TiO2 en la cámara.
  9. Se lavan las federaciones nacionales de TiO2 dos veces más siguiendo misma condición del paso 3.8, y eliminar el tampón de lavado residual por completo haciendo girar el disco a 2.400 rpm durante 20 segundos. A continuación, cierre la válvula # 5.
  10. Para la reacción quimioluminiscente, aplicar un modo de mezcla (30 Hz s -1, 2 °) durante 1 min después de la transferencia de la solución de sustrato quimioluminiscente a la cámara de reacción de unión mediante la apertura de la válvula # 6 e hilaturael disco a 2400 rpm durante 10 seg posteriormente.
  11. Transferir la solución de sustrato reaccionado a las cámaras de detección mediante la apertura de la válvula # 7 y girando el disco a 2400 rpm durante 10 s.
  12. Medir las señales de quimioluminiscencia de la solución de sustrato reaccionado usando un tubo fotomultiplicador (PMT) módulo equipado sistema de detección.
    NOTA: El sistema de detección es una máquina hecha a la medida usando las siguientes partes: motor paso a paso, los componentes óptico-mecanicos, platinas de traslación, y PMT disponible en el mercado. Las partes y óptico-motor paso a paso se ensamblan para mantener el dispositivo, y el motor puede girar el disco. La detección se realiza por PMT fija en las partes óptico-mecanicos, y se encuentra por encima de las cámaras de detección del dispositivo. Mediante la manipulación del motor paso a paso, las cámaras de detección están alineados justo debajo de la zona de detección de PMT.

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Resultados

El uso de este protocolo, un dispositivo de microfluidos centrífuga totalmente automatizado para la detección de proteínas de la sangre total se preparó con una alta sensibilidad. Las esteras de TiO2 NF fueron preparados por los procesos de electrospinning y calcinación. Con el fin de fabricar el FNs de diámetro deseado, la morfología y espesor, electrospinning condiciones tales como velocidad de flujo, tensión, y el tiempo de hilado fueron optimizados. Cuando las cond...

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Discusión

El ensayo en TiO 2 NF disco integrado es una técnica rápida, de bajo costo y conveniente para la detección ultrasensible de proteínas de baja abundancia presentes en muy bajo volumen de sangre. Esta técnica tiene la ventaja de usar pequeños volúmenes de muestra (10 l) y es susceptible para el análisis de múltiples muestras simultáneamente. Esto proporciona un gran potencial como un dispositivo de multiplexación inmunoensayo. El dispositivo tiene la ventaja de que no requiere etapas de pretratamient...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) subvenciones (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), una subvención de la tecnología de la salud R coreana + D Proyecto, Ministerio de Salud y Bienestar Social (A121994) y el SII-R020-D1 financiado por el Gobierno de Corea.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Si waferLG SILTRONPolished Wafer, test gradeDia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC) Daedong PlasticPCS#6900Thickness (mm) = 1 and 5 
Titanium tetraisopropoxide, 98%,Sigma-Aldrich205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000Sigma-Aldrich437190
Acetic acidSigma-Aldrich320099
Anhydrous ethanolSigma-Aldrich459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilaneSigma-Aldrich448931
PDMS and curing agentDow CorningSYLGARD 184
GPDESGelest IncSIG5832.0 
EthanolJ T Baker
FE-SEMFEINova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopyThermoFisherK-alpha
3D modeling machineM&I CNC Lab, KoreaCNC milling machine
Wax-dispensing machineHanra Precision Eng. Co. Ltd., KoreaCustomized
Double-sided adhesive tapeFLEXcon, USADFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotterGraphtec Corporation, JapanGraphtec CE3000-60 MK2
Spin coaterMIDASSPIN-3000D
Furnace (calcination)R. D. WEBB COMPANYWEBB 99
Rheometer (Tack test)Thermo ScientificHaake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma systemFEMTOCUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRPHytest Ltd., Finland4C28(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnIHytest Ltd., Finland4T21(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRPAbcam plc., MAab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnIAbcam plc., MAab24460(clone # 16A11)
hsCRPAbcam plc., MAab111647
cTnIFitzgerald, MA30-AT43
Bovine AlbuminSigma-AldrichA7906
PBSAmresco IncE404
Blood collection tubesBD vacutainer367844K2 EDTA 7.2 mg plus blood
collection tubes
SuperSignal ELISA femtoInvitrogen37074
Modular multilabel plate readerPerkin ElmerEnvision 2104
Disc operating machineHanra Precision Eng. Co. Ltd., KoreaCustomized
Photomultiplier tube (PMT)Hamamatsu PhotonicsH1189-210
AutoCADAutoDeskVersion 2012Design software
SolidWorks 3D CAD software SOLIDWORKS Corp.Version 20133D Design software,
EdgecamVero softwareversion 2009.01.06928Code generating software
DeskCNCCarken Co.version 2.0.2.18CNC milling machine software

Referencias

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